[发明专利]以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉一种穿梭质粒及其制备方法和应用，具体是涉及一种以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2及其制备方法和应用。 

背景技术

本发明基于改造了一株来源于深海细菌希瓦氏菌WP3（Shewanella piezotolerans WP3）的丝状噬菌体（已经发表于《shewanella psychrophila sp.nov.and Shewanella piezotolerans sp.nov.,isolated from west Pacific deep-sea sediment》,2007）。噬菌体是病毒的一种，其特别之处是专以细菌为宿主，它是一团由蛋白质外壳包裹的遗传物质，大部分噬菌体还长有“尾巴”，用来将遗传物质注入宿主体内。本专利改造的丝状噬菌体命名为SW1，其基因组全才度为7718bp，含有9个可能的开放阅读框，编码与其生命活动相关的蛋白组分，如噬菌体复制单元，结构单元，组装单元与调控单元。当噬菌体SW1侵染WP3时，它不仅会整合到WP3的基因组上，同时还会产生双链的复制形式，由于这种特性，使得将其改造成为WP3的天然质粒载体成为可能。 

目前，直接在噬菌体的基础上改造的穿梭质粒还比较少见，在大肠杆菌和希瓦氏菌中都能够复制表达的以噬菌体为基础的穿梭质粒还未见报道。因此，开发出一种既能够在大肠杆菌内复制表达，也可以在不同的希瓦氏菌中复制表达的穿梭质粒有其实际的意义。本专利构建的以噬菌体为基础的穿梭质粒能够在多种宿主下复制并表达外源蛋白。同时本专利运用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光，故可以作为基因表达的报告基因，进行启动子的筛选标准，筛选到了一系列能够在低温下表达的蛋白的启动子，其中一个启动子在低温下有较高的表达强度，能够在低温下高效的表达外源蛋白。高效的低温启动子配合宿主菌WP3的低温生长特性，为表达低温蛋白开拓了一个新的工具。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种既能够在大肠杆菌内复制表达、也可以在不同的希瓦氏菌中复制表达的以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2，同时提供了以pSW2为基础的衍生质粒，以及以GFP为报告基因的启动子筛选载体。本发明还提供了制备上述穿梭质粒 pSW2及其衍生质粒的方法和其应用。 

本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，一种以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，一种制备上述穿梭质粒pSW2的方法，包括以下步骤： 

步骤一，先将噬菌体中结构单元和组装单元中与质粒复制表达非必需的基因敲除； 

步骤二，氯霉素基因的克隆； 

步骤三，复制起始位点的克隆； 

步骤四，结合转移元件的克隆； 

步骤五，多克隆位点的构建； 

步骤六，利用融合PCR的方法将上述各个元件融合成一个大片段后，通过T4连接酶将其插入到敲除了非必需基因的区域，获得pSW2表达载体； 

步骤七，将所述pSW2表达载体在E.coli DH5α中进行质粒扩增并酶切验证，然后将其转入WM3064再次验证，再接合转移入希瓦氏菌WP3验证其成功转入。 

优选的，在步骤一中，所述基因包括衣壳蛋白基因和zot-like通道蛋白基因。 

优选的，在步骤二中，所述氯霉素基因选自pCC2FOS载体，其基因全长660bp。 

优选的，在步骤三中，所述复制起始位点选自pMD18T载体。 

优选的，在步骤四中，所述结合转移元件选自pRE112质粒。 

优选的，在步骤五中，所述多克隆位点包括：MluⅠ、SphⅠ、Sse8387Ⅰ、PstⅠ、SalⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、XmaⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、XhoⅠ。 

本发明的第三个目的是通过以下技术方案实现的，一种构建以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2的衍生质粒的方法，包括以下步骤： 

步骤一，在上述穿梭质粒pSW2的多克隆位点引入GFP（绿色荧光蛋白）作为报告基因； 

步骤二，通过基因芯片方法与蛋白2D电泳方法筛选到在低温下高表达的基因；