[发明专利]以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2，其特征是，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种制备权利要求1所述以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2的方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤一，先将噬菌体中结构单元和组装单元中与质粒复制表达非必需的基因敲除；

步骤二，氯霉素基因的克隆；

步骤三，复制起始位点的克隆；

步骤四，结合转移元件的克隆；

步骤五，多克隆位点的构建；

步骤六，利用融合PCR的方法将上述各个元件融合成一个大片段后，通过T4连接酶将其插入到敲除了非必需基因的区域，获得pSW2表达载体；

步骤七，将所述pSW2表达载体在E.coli DH5α中进行质粒扩增并酶切验证，然后将其转入WM3064再次验证，再接合转移入希瓦氏菌WP3验证其成功转入。

3.如权利要求2所述的制备以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2的方法，其特征是，在步骤一中，所述基因包括衣壳蛋白基因和zot-like通道蛋白基因。

4.如权利要求2所述的制备以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2的方法，其特征是，在步骤二中，所述氯霉素基因选自pCC2FOS载体，其基因全长660bp。

5.如权利要求2所述的制备以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2的方法，其特征是，在步骤三中，所述复制起始位点选自pMD18T载体。

6.如权利要求2所述的制备以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2的方法，其特征是，在步骤四中，所述结合转移元件选自pRE112质粒。

7.如权利要求2所述的制备以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2的方法，其特征是，在步骤五中，所述多克隆位点包括：MluⅠ、SphⅠ、Sse8387Ⅰ、PstⅠ、SalⅠ、BamH Ⅰ、SmaⅠ、XmaⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、XhoⅠ。

8.一种构建以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2的衍生质粒的方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤一，在权利要求1所述穿梭质粒pSW2的多克隆位点引入GFP作为报告基因；

步骤二，通过基因芯片与蛋白2D电泳筛选到在低温下高表达的基因；

步骤三，用PCR的方法提取基因的启动子序列，连入GFP报告基因之前，作为一个表达单元；

步骤四，用酶标仪测定GFP的表达强度，以筛选到低温下高表达的启动子；

步骤五，利用一个在低温下表达强度最高的启动子构建低温蛋白表达载体，以深海细菌希瓦氏菌WP3作为低温蛋白表达宿主。

9.如权利要求1所述的以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2在利用外源基因表达低温蛋白中的应用。

10.如权利要求1所述的以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2在希瓦氏菌中基因回补的应用。