[发明专利]一种双酶偶联制备β-丙氨酸的方法

说明书

 一、技术领域

   本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双酶法制备β-丙氨酸的方法。

二、背景技术

β-丙氨酸是合成泛酸的前体，泛酸是B族维生素的一种，构成辅酶A的一部分，对于各种组织内的内源代谢能量交换都很重要。随着对β-丙氨酸认识的逐渐加深，β-丙氨酸在医药、食品、化妆品、饲料等领域应用日益广泛，对β-丙氨酸的市场需求也在不断增长，因此β-丙氨酸具有广泛的应用前景和开发价值。

目前根据文献报道β-丙氨酸的制备方法主要有化学合成法和生物酶法。

1、化学合成法

化学合成法有丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺（丁二酞亚胺）降解法、β-氨基丙腈法，双氰乙基胺法。其中β-氨基丙腈法和丙烯腈法原料价格便宜，但中间产物水解后分离比较困难，特别是β-丙氨酸与副产物分离比较复杂，水解过程生成大量无机盐。该方法的工艺条件要求苛刻，且易发生其它副反应，工业化生产和环保治理难度大，生产成本高。

Buc等以丙烯腈与氨水发生氨化反应生成β-氨基丙腈，在酸性或碱性条件下水解，经分离制备β-丙氨酸。

2、生物酶法

（1）腈降解酶

川利洋等利用产有机腈降解酶的微生物催化β-氨基丙腈水解合成β-丙氨酸，微生物Alcaligenes sp. OMT-MY14，Achromobatrer xerosis IF012668，  Pseodonocardia thermophila ATCC19285，AminoBacter aminobrance ATCC23314能够催化β-氨基丙腈水解，其中Alcaligenes sp. OMT-MY14催化效果最佳，在30℃，其游离细胞在缓冲液中催化1.0% β-氨基丙腈水解反应1 h，β-丙氨酸浓度达到47 mmol/L。

田胁新一郎等利用微生物如Micrococcus lysodeikticus ATCC4698、Micrococcus luicus ATCC12698、Corynebacrerium glutamscum ATCC21253等转化β-氨基丙醇，30℃反应30 h，β-丙氨酸浓度达4.0 mg/mL。

（2）天冬酸氨酸-α-脱羧酶

天冬氨-α-脱羧酶酶法生产工艺是以L-天冬氨酸为原料、脱羧酶为催化剂的一步生化反应，其设备简单、反应条件温和、酶活力高、反应速度快、专一性强。脱羧酶法生产β-丙氨酸已成为近年来人们关注和研究的方向。

Wiliamson（J. Biol. Chem. 1979, 254: 8074-8082）等以微生物湿菌体或粗酶液为酶源，以L-天冬氨酸为底物，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.5），于42℃酶促转化，反应20 min，得到含β-丙氨酸的反应液，经分离提取制得β-丙氨酸，天冬氨酸-α-脱羧酶Km值约为160 μmol/L。

Cronan（J. Biol. Chem. 1980, 141(3): 1291-1297）以微生物湿菌体或粗酶液为酶源，以L-天冬氨酸为底物，0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.8），于37℃酶促转化，反应1～2 h得到含β-丙氨酸的反应液，经分离提取制得β-丙氨酸，天冬氨酸-α-脱羧酶Km值约为80 μmol/L。

洪敏等（浙江工业大学学报, 2011, 39(3): 252-256）以L-天冬氨酸为底物，以天冬氨酸-α-脱羧酶基因工程菌（pET-28c(+)-panD）酶法合成了β-丙氨酸，酶活达到186 U。

高丽娟（浙江工业大学硕士学位论文, 2007）以L-天冬氨酸为底物，以天冬氨酸-α-脱羧酶基因工程菌（pET-21c(+)-panD）酶法合成了β-丙氨酸，酶活达到224.96 U。

三、发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的直接以富马酸铵为原料双酶法制备β-丙氨酸的方法。本发明以富马酸铵为原料，以天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脱羧酶双酶偶联制备β-丙氨酸。

本发明可以通过以下技术方案来达到：

β-丙氨酸的双酶法转化制备方法，其步骤为：

（1）分别将具有天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脱羧酶活性的菌株，在培养基中培养产生高活性的天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脱羧酶；