[发明专利]一种检测液体样品中外囊体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测液体样品中外囊体的方法。

背景技术

表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）传感技术是一种表面敏感的检测方法，与其他的生物检测方法相比，SPR传感分析系统具有非标记的、实时检测相互作用动力学等优点。基于SPR技术的表面等离子体共振成像（surface plasmon resonance imaging，SPRi）分析系统在保持了SPR检测技术优点的基础上，增加了检测的容量，SPRi可以同时检测几百上千个相互作用，是一种高通量的检测技术。

外囊体（exosome）是直径在40-100纳米范围的由磷脂双分子层包围的扁平球形的微小囊泡体。外囊体的形成过程比较复杂，目前科学研究工作者普遍认为外囊体起源于细胞内吞过程中形成的多囊体（multivesicular body,MVB）。细胞内膜由于细胞内吞在细胞内部形成较大的泡状物，泡的底部与细胞内膜分离后在细胞内部独立行驶功能，泡的介膜再向内出芽(二次内吞)，在泡的内部形成膜包围的结构，这种结构在泡状物的膜上大量形成，其基部逐渐与MVB的膜分离，脱离后就形成了MVB内小囊泡，MVB膜胞质面形成了小囊泡的内面，小囊泡里面包裹的主要是细胞质。MVB的代谢途径一般有二种：一部分MVB被转运到溶酶体降解；另一部分MVB的泡膜与质膜融合后释放小泡到胞外空间形成外囊体。

外囊体不仅可以由细胞分泌，例如目前已经报道的B细胞，树状细胞，肥大细胞，上皮细胞以及肿瘤细胞，并且外囊体也可以在许多种的体液中发现，例如，在支气管肺泡灌洗液，血液，尿液和腹水都大量存在。生理学上来说，外囊体不仅仅在细胞内部行驶功能，并且也可以担任功能单元在细胞通信方面起到重要作用，在产生外囊体的细胞以及目标细胞之间交换蛋白以及其它脂类物质。然而，由于外囊体表面有大量的蛋白存在，并且其存在的环境不管是细胞培养上清还是体液中都存在大量的杂蛋白，这阻碍了外囊体的进一步研究。目前文献中报道的提纯外囊体的方法主要有两种：超高速（大于100,000g的离心力）离心超滤提纯以及蔗糖密度梯度离心，这两种方法都需要多个转移细胞培养上清的步骤转移，昂贵的设备和长时间的离心制备，并且有可能在转移的过程由于保存不当使上清变质破环外囊体的结构，从而影响检测结果，甚至于破坏检测的可信性；目前生物学上研究外囊体的常规技术主要有：质谱（MS），核磁共振（NMR）以及免疫印记（Western Blotting）和酶联免疫技术（ELISA），但是这些技术都需要提纯后才能进行检测，现有技术通常采用离心的方法对外囊体进行提纯，提纯的过程一般包括低速离心10分钟、高速离心30分钟和超高速离心150分钟，复杂的离心过程是现有技术检测液体样品中外囊体技术中存在的缺陷。因此目前需要一种省去复杂的离心过程的直接检测细胞培养上清中外囊体的方法来推进外囊体研究的进一步发展。虽然最近有一种基于免疫磁珠直接检测细胞培养上清中外囊体的方法，但是这种方法仍旧需要用HRP等二抗对外囊体进行标记才能进行功能上的研究，并且标记技术容易增加非特异性相互作用以及检测背景噪声，对检测结果的可信性造成负面影响。

发明内容

本发明的目的在于克服现有外囊体检测技术中存在的上述不足，提供一种依托于表面等离子体共振成像技术的不需要复杂提纯过程、准确可靠地实时定量检测液体样品中外囊体的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种检测液体样品中外囊体的方法，所述待测液体样品含有外囊体；所述方法包括：在微阵列芯片表面通入待测液体样品进行接触，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，获得所述微阵列芯片在接触待测液体样品前后的表面等离子体共振信号变化值；所述微阵列芯片的表面等离子体共振信号变化值指示了待测液体样品中外囊体的数量。

本发明还提供了一种微阵列芯片在制备用于检测液体样品中外囊体的试剂盒中的用途，所述微阵列芯片的表面负载有一种或多种外囊体表面膜蛋白的特异性抗体，且所述微阵列芯片用于测定表面等离子体共振信号变化值。

利用本发明所提供的方法能够快速、专一、实时、无需标记的定量检测液体样品中的外囊体。本发明所提供的微阵列芯片能够应用于检测液体样品中外囊体的试剂盒。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：