[发明专利]一种红色荧光钙离子探针的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种红色荧光钙离子探针的制备方法，属于化学合成技术及生化分析检测技术领域。 

背景技术

荧光探针技术的发展推动了许多复杂生理机制的阐明，其中，钙离子荧光成像技术已成为研究涉及钙离子的信号通路的关键技术。由于许多生物学现象中都涉及钙离子信号变化，那么同时对钙离子和其它生物分子进行多色成像分析，将大大增加获得的信息量。因此，钙离子荧光探针的开发和不断改良具有重要意义。 

按荧光信号基团，钙离子荧光探针大致可分为基于基因编码的荧光蛋白和基于荧光小分子两类，尽管两类探针各有优缺点，但基于有机小分子的荧光探针因其可以形成细胞渗透性乙酰氧基甲酯（AM）衍生物形式而很容易地大量装载入活细胞，不需要像荧光蛋白一样的转染步骤，故更易操作。现有的基于小分子的钙离子荧光探针大都以发绿色荧光的荧光素为荧光基团，例如Fluo-3，Fluo-4，Calcium Green-1和Oregon Green 488 BAPTA-1。也有一些发红色荧光的钙离子探针，例如一种基于罗丹明结构框架、发光波长为576 nm的Rhod-2探针。尽管这样的红色荧光钙离子探针在生物学研究中也得到了广泛应用，但是由于Rhod-2探针中罗丹明结构框架的阳离子性质，该探针常被非特异性地吸附于线粒体。虽然这种定位可以用于监测线粒体的钙离子动态，但相比于线粒体，胞浆内的钙离子成像对研究钙离子相关的信号通路更为重要。Fura Red是一个有代表性的发射近红外荧光的钙离子探针，然而它的荧光量子产率却相当低，仅有0.013，因此要想得到较强的信号，就必须增加探针用量或用高能量的激光激发荧光，但是增加探针用量会对钙离子产生缓冲效应，而高能量激光又会导致荧光分子的快速漂白和对细胞产生光毒性。因此，有必要开发新的钙离子探针，不但使其在长波长区（红色）有较强的荧光发射，而且需要使该探针能够有效的监测胞浆内的钙离子动态。   

发明内容

本发明的目的是解决现有红色荧光钙离子探针的荧光量子产率低、信号较弱的问题，提供一种红色荧光钙离子探针的制备方法以及使用所述的红色荧光钙离子探针对胞浆内钙离子的动态监测应用。 

本发明的目的通过下述方案实现： 

一种红色荧光钙离子探针的制备方法，包含以下步骤：

(1) 在容有3~25 mL DMF的反应容器内，按摩尔比1:1.2~1:1.4加入多肽偶联剂2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）0.2~2.2 mmol和1-羟基苯并三唑(HOBt) 0.24~3.1 mmol，再按摩尔比1.5:1 ~ 1:5加入具有红色荧光的荧光素类似物或其衍生物0.02~0.2 mmol与1,2-双（2-氨基苯氧基）-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸（BAPETA）或其衍生物0.013~1.0 mmol，氩气保护下磁力搅拌过夜；

 (2) 向步骤(1)所得溶液中加入2~10 mL 0.5~1 M盐酸后，以二氯甲烷提取产物，有机相用盐水洗涤、Na₂SO₄干燥、挥发溶剂至完全干燥，再向所得固体加入1~5 mL 1 M氢氧化钠和2~10 mL甲醇，室温搅拌2~5小时后以1 M盐酸中和；

或者，

所述步骤（2）替换为：向步骤(1)所得溶液中加入1 mL 乙酸，振摇；

(3) 以柱色谱提纯，制得红色荧光的荧光素类似物或其衍生物与BAPETA或其衍生物的共价结合物，即本发明所设计的红色荧光钙离子探针。

其中， 

步骤 (1) 中所述的红色荧光的荧光素类似物（或其衍生物）包括下列F1、F2两种化合物：

F1(X=H)；F2(X=Cl)

所述的1,2-双（2-氨基苯氧基）-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸（BAPETA）或其衍生物包括下列C1、C2两种化合物：

C1(Y=H)；C2(Y=CH₂OCOCH₃)  。

步骤 (1) 中所述以多肽偶联剂2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）和1-羟基苯并三唑(HOBt)催化红色荧光的荧光素类似物（或其衍生物）的羧基与BAPETA（或其衍生物）的氨基偶联。