[发明专利]一种红色荧光钙离子探针的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种能够对动物细胞胞浆内钙离子实时荧光检测的红色荧光钙离子探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1) 在容有3~25 mL DMF的反应容器内，按摩尔比1:1.2~1:1.4加入多肽偶联剂2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）0.2~2.2 mmol和1-羟基苯并三唑(HOBt) 0.24~3.1 mmol，再按摩尔比1.5:1 ~ 1:5加入具有红色荧光的荧光素类似物或其衍生物0.02~0.2 mmol与1,2-双（2-氨基苯氧基）-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸（BAPETA）或其衍生物0.013~1.0 mmol，氩气保护下磁力搅拌过夜；

(2) 向步骤(1)所得溶液中加入2~10 mL 0.5~1 M盐酸后，以二氯甲烷提取产物，有机相用盐水洗涤、Na₂SO₄干燥、挥发溶剂至完全干燥，再向所得固体加入1~5 mL 1 M氢氧化钠和2~10 mL甲醇，室温搅拌2~5小时后以1 M盐酸中和；

(3) 以柱色谱提纯，制得红色荧光的荧光素类似物或其衍生物与BAPETA或其衍生物的共价结合物，即本发明所设计的红色荧光钙离子探针。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）替换为，向步骤(1)所得溶液中加入1 mL 乙酸，振摇。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤 (1) 中所述的红色荧光的荧光素类似物或其衍生物包括下列F1、F2两种化合物：

F1(X=H)；F2(X=Cl) ；

所述的1,2-双（2-氨基苯氧基）-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸（BAPETA）或其衍生物包括下列C1、C2两种化合物：

C1(Y=H)；C2(Y=CH₂OCOCH₃) 。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤 (1) 中以多肽偶联剂2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）和1-羟基苯并三唑(HOBt)催化红色荧光的荧光素类似物或其衍生物的羧基与BAPETA或其衍生物的氨基偶联。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤 (3) 所制得的红色荧光钙离子探针以带有红色荧光的荧光素类似物或其衍生物F1、F2为荧光报告基团、以1,2-双（2-氨基苯氧基）-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸（BAPETA）C1或其衍生物C2为钙离子螯合基团。

6.一种权利要求1及权利要求2所述方法制备的红色荧光钙离子探针，包括探针1、探针2、探针3，结构式如下， 

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