[发明专利]利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因番茄及其深加工产品，具体而言是一种适用于番茄及其深加工产品中转基因成分的四重荧光定量PCR检测方法，属于食品安全转基因检测领域。

背景技术

番茄（Solanum lycopersicum）是茄科番茄属的一年生或多年生植物。作为一种蔬菜作物，番茄是最早进行基因转化研究的高等植物之一，为基因工程拓宽种质资源研究打下坚实基础，已成为蔬菜基因工程研究的模式植物之一。自 1994年美国Calgene公司成功开发，全球首次批准商品化种植的延熟转基因植物产品——番茄FLAVR SAVR被批准进行商业化生产后，利用基因工程进行番茄品种特性改良的研究取得了很大进展，已培育出延迟成熟、抗病虫害、抗除草剂、抗病毒、抗逆和高品质的优良转基因番茄品种，有一部分番茄品种早已在美国、加拿大、日本、墨西哥和中国获准商品化种植。

随着现代基因工程技术的迅猛发展，越来越多的转基因产品被成功制造出来并实现了商品化生产。但转基因产品可能存在潜在的环境污染，食用安全及生态风险，对人类健康和自然环境带来不利影响。因此，需要加强对转基因产品的有效监督、监测和管理。欧盟、日本、韩国、挪威等国明确规定转基因产品的限量标准并制定相应法规实行转基因产品标签标识制度。我国也十分重视转基因食品的安全管理，颁发了《农业转基因生物安全管理条例》，并对17种转基因产品要求必须加贴标识。

转基因产品的检测目前主要采用PCR检测方法，包括定性PCR、巢氏PCR、多重PCR和荧光定量PCR。根据检测的靶标基因又分为通用元件筛选检测，基因特异性检测，构建特异性检测和品系特异性检测四个检测水平。目前转基因食品种类繁多，转入的靶基因各异，很难通过检测所有的外源基因来确定是否含有转基因成分，筛选检测是对目前商品化生产和正在研究的转基因产品普遍转入的通用的转基因元件，即花椰菜花叶病毒35S启动子（35S promoter from cauliflower mosaic virus）、胭脂碱合成酶NOS终止子（Terminator of nopaline synthase gene）、玄参花叶病毒35S启动子（35S promoter from caulimovirus group）、新毒素转移酶基因NPTII（Neomycin transferase gene）等进行筛查检测，是目前较为快速有效的检测方法。

近年来新发展的多重荧光定量 PCR技术，即在一个反应体系中含两对以上引物和不同荧光基团标记的探针，通过实时荧光反应可同时检测多种目标基因。在当前导入农产品中的外源基因种类越来越多的情况下，单一项目的检测已不能满足食品监管需要，迫切需要开发高通量的快速转基因检测技术。建立快捷准确的多重荧光定量PCR方法进行转基因产品的初筛试验是目前较可行的办法。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，本发明属于多重荧光定量PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，实现对待测番茄样品是否为转基因番茄的快速、高效的检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，包括以下步骤：

①、设计四重荧光定量PCR扩增所需的引物和探针：

所述四重荧光定量PCR为根据转基因番茄常用35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII序列进行四重荧光定量PCR检测；

②、待测番茄样品中基因组DNA的提取；

③、四重荧光定量PCR扩增体系设置；

④、判定待测番茄是否为转基因番茄。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的改进：

所述步骤①中：探针5’ 荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’ 淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的进一步改进：

步骤①中所用的引物和探针分别为：

内外源基因的扩增引物为：

P-35S-F: GACATTGCGATAAAGGAAAGGC

P-35S-R: GGGTCCATCTTTGGGACCA

T-NOS-F：TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTC