[发明专利]利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法

权利要求书

1.利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是包括以下步骤：

① 、设计四重荧光定量PCR扩增所需的引物和探针：

所述四重荧光定量PCR为根据转基因番茄常用35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII序列进行四重荧光定量PCR检测；②、 待测番茄样品中基因组DNA的提取；

③ 、四重荧光定量PCR扩增体系设置；

④ 、判定待测番茄是否为转基因番茄。

2.根据权利要求1所述的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是：

所述步骤①中：探针5’ 荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’ 淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。

3.根据权利要求1或2所述的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是：

所述步骤①中所用的引物和探针分别为：

内外源基因的扩增引物为：

P-35S-F: GACATTGCGATAAAGGAAAGGC

P-35S-R: GGGTCCATCTTTGGGACCA

T-NOS-F：TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTC

T-NOS-R：ACATGCTTAACGTAATTCAACAG

NPTII-F：CGGCACTTCGCCCAATAG

NPTII-R：GCTGTGCTCGACGTTGTCA

Lat52-F：AGACCACGAGAACGATATTTGC

Lat52-R：TTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA

内外源基因探针为：

P-35S-P：FAM-ATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACA-BHQ1

T-NOS-P：Cy5-AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGAT-BHQ3

NPTII-P：VIC-CCAGTCCCTTCCC-MGB

Lat52-P：NED-AGCCCAAGGGAGGAC-MGB  。

4.根据权利要求3所述的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是：

所述步骤④判定待测番茄是否为转基因番茄为：

根据四重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测番茄样品中是否含有转基因成分；内源基因Lat52 Ct值必须小于35，表明样品基因组DNA提取有效，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常；否则检测无效；

在确定Lat52 Ct值﹤35时，当且外源基因无S曲线产生或Ct值＞40时，待测番茄样品的判定结果为阴性；当外源基因Ct值＜35时，待测番茄样品的判定结果为阳性；当35≤外源基因Ct值≤40时，对待测番茄样品重新进行检测，重新进行检测所得的外源基因Ct值≥40时，待测番茄样品的判定结果为阴性，重新进行检测所得的外源基因Ct值≤35时，待测番茄样品的判定结果为阳性；

当外源基因中的P-35S、 T-NOS、NPTII中的任意一条特异性S曲线被检测出时，待测番茄样品的判定结果为阳性。

5.根据权利要求4所述的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是：

25μL的四重荧光定量PCR扩增体系为：检测引物和探针浓度分别为80~800nM，12.5μL QuantiFast Multiplex PCR Master Mix（2×，Qiagen），基因组DNA 50~100 ng；ddH2O补足至25μL。

6.根据权利要求4所述的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是：

25μL的四重荧光定量PCR扩增体系为：

ddH2O补足至25μL。

7.根据权利要求5或6所述的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是：

四重荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，60℃退火并延伸90 sec，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。