[发明专利]一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌，其特征在于，它是利用PCR扩增克隆嘌呤补救合成途径的关键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt，将上述基因片段连接到过表达载体，然后利用电转化的方法转化节杆菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因的工程菌。

2.根据权利要求1所述的过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌，其特征在于，所述的表达载体为游离质粒载体。

3.根据权利要求2所述的过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌，其特征在于，所述的表达载体为pARK。

4.权利要求1所述的过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）设计PCR引物扩增次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt；

（2）将克隆得到的目的基因插入pARK的组成型启动子hndO下游多克隆位点，得到pARK-HG过表达质粒；

（3）然后将pARK-HG过表达质粒导入大肠杆菌DH5a中，以备扩增后电转化；

（4）将经提取、浓缩后的pARK-HG过表达质粒电转化节杆菌，30℃复苏8小时候，涂布卡那霉素抗性平板，再在30℃培养36小时，筛选转化子；

（5）转化子经质粒提取后，利用PCR进行验证，从而获得过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt的节杆菌重组菌AR-HG。

5.权利要求1所述的过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌在制备cAMP中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，制备方法包括如下步骤：

（1）将节杆菌重组菌AR-HG单菌落划线至斜面种子培养基，30℃培养48-72小时；

（2）刮一环菌体接种到装有50mL液体种子培养基的500mL摇瓶中，30℃，200-250rpm摇床中培养24小时，制备种子液；

（3）以10(v/v)%的接种量，接种到发酵培养基中，25-35℃、pH7.0-7.2、通风量4-12L/min、搅拌转速250-350rpm条件下，发酵48-96小时。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏10g/L，pH7.2；所述的斜面种子培养基为种子培养基中加入琼脂2wt%。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基组成为：葡萄糖40g/L，K₂HPO₄18g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，尿素10g/L，CoCl₂0.005g/L，NaF0.4g/L，生物素0.01g/L，次黄嘌呤6g/L，pH7.0。