[发明专利]一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

环磷酸腺苷（cyclic adenosine-3’,5’-monophosphate，简称cAMP），是一种具有细胞内信息传递作用的小分子，被称为第二信使，在生物体内广泛存在，对糖代谢、脂肪代谢、核酸合成、蛋白质合成以及细胞分化、癌变、逆转等多种生理生化过程发挥着重要的调控作用。在临床上，cAMP可用于治疗心血管疾病、甲亢、慢性肾功能不全、神经系统疾病、肝胆疾病和呼吸系统疾病等。作为动物饲料添加剂，cAMP既具有拟生长激素的作用，能够促进动物生长，提高乳畜产奶量、肉畜增重率和绵羊产毛量。作为医药中间体，cAMP能派生出一系列重要的衍生物，如环磷酸腺苷葡甲胺和二丁酰环磷酸腺苷，用于治疗心脑血管疾病和恶性肿瘤等。cAMP作为一种典型的精细化学品，具有重要的应用价值和广阔的市场前景，因此受到广泛关注。

化学合成法是目前国内外产业化生产cAMP的主要方法，但是存在收率低、环境污染严重、生产成本高等严重缺陷；而酶法又存在酶稳定性差、底物昂贵等问题，因此，急需开发条件温和、成本廉价、环境友好的新工艺来进行替代。

目前，国内外对于发酵法生产cAMP菌株的改造主要是通过传统诱变的方式筛选底物耐受性菌株，或是肌苷酸脱氢酶缺失型菌株，尚未有通过分子生物学技术改造菌株来提高cAMP产量。因此通过基因工程技术构建高产优良菌株，进一步提高cAMP产量，具有重要的经济价值和社会意义。

发明内容

本发明提所要解决的技术问题是提供一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt基因）的节杆菌，通过过表达hgprt基因提高cAMP的产量。

本发明还要解决的技术问题是提供上述节杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述节杆菌的应用。

hgprt基因是编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶是嘌呤补救合成途径的关键酶。而嘌呤补救合成途径是生产cAMP的主要途径，基于以上理论分析，过表达hgprt基因，能够增大补救合成途径的代谢流量，有利于提高cAMP产量，降低成本。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌，它是利用PCR扩增克隆嘌呤补救合成途径的关键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt，将上述基因片段连接到过表达载体，然后利用电转化的方法转化节杆菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因的工程菌。

其中，所述的表达载体为游离质粒载体。优选的，所述的表达载体为pARK。所述表达载体中的组成型启动子为hndO。

上述过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌的构建方法，该方法包括如下步骤：

（1）设计PCR引物扩增次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt；

（2）将克隆得到的目的基因插入pARK的组成型启动子hndO下游多克隆位点，得到pARK-HG过表达质粒；

（3）然后将pARK-HG过表达质粒导入大肠杆菌DH5a中，以备扩增后电转化；

（4）将经提取、浓缩后的pARK-HG过表达质粒电转化节杆菌，30℃复苏8小时候，涂布卡那霉素抗性平板，再在30℃培养36小时，筛选转化子；

（5）转化子经质粒提取后，利用PCR进行验证，从而获得过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt的节杆菌重组菌AR-HG。

上述过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌在制备cAMP中的应用。

具体制备方法包括如下步骤：

（1）将节杆菌重组菌AR-HG单菌落划线至斜面种子培养基，30℃培养48-72小时；

（2）刮一环菌体接种到装有50mL液体种子培养基的500mL摇瓶中，30℃，200-250rpm摇床中培养24小时，制备种子液；

（3）以10(v/v)%的接种量，接种到发酵培养基中，25-35℃、pH7.0-7.2、通风量4-12L/min、搅拌转速250-350rpm条件下，发酵48-96小时；优选在30℃、pH7.0-7.2、通风量8L/min、搅拌转速350rpm条件下，发酵72小时。

其中，所述的种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏10g/L，pH7.2；所述的斜面种子培养基为种子培养基中加入琼脂2wt%。