[发明专利]一种耐低温草菇菌株及其选育方法

权利要求书

1.一种耐低温草菇菌株，其生物保藏号为：CCTCC NO：M2013207。

2.根据权利要求1所述的耐低温草菇菌株，其特征在于，所述耐低温草菇菌株菌落4d长满平板，初期为白色，中期从中心向边缘逐渐变淡黄色，后期颜色加深变红，培养基出现红铁锈色；菌株菌丝部分内生，气生菌丝较多，菌丝有隔，多分枝，菌丝直径4.01～11.98μm，菌丝长25.62～320.08μm，菌丝细胞内多核，细胞之间未见锁状联合；能正常出菇，菌丝在0℃条件下42h仍然有生命活力，子实体10℃条件下可储藏28h。

3.如权利要求1或2所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)出发菌株库构建

收集到16株草菇菌株V23、V9715、V9、V106、V97、V874、V5-2、VW、VG、VT-1、VT-2、V14、NO3、VB2、V28、V5，构建多基因型出发菌株库；

2)原生质体制备

将16株出发菌株分别接种于PDA固体培养基上，32±0.5℃恒温培养3～4d，取PDA固体培养基上生长旺盛的菌丝，接种于PDA液体培养基中，32±0.5℃条件下静止培养，每天早晚各摇动1次；将培养1～3d的菌丝用无菌水洗涤干净后用灭菌滤纸吸去表面水分待用；

收集菌丝，按每150～250mg菌丝加1mL酶液量进行酶解，酶解温度30±0.5℃，酶解时间1.5～4h，酶解后将酶解液用灭菌的G3砂芯漏斗过滤，滤液以3000～3500r/min离心10min，去除上清液，用0.6mol/L甘露醇溶液洗涤2～3次，得到纯化后洁白的原生质体；

3)原生质体诱变

将每株出发菌株的纯化后原生质体均分为4份，分别进行电子束诱变、⁶⁰C_o-γ诱变、紫外线诱变、EMS诱变，诱变后的原生质体再生培养；

4)变异菌株筛选

步骤3)诱变的草菇原生质体再生后，放置0±0.5℃条件下处理20～26h，然后，放置32±0.5℃条件下培养，4d后选取没有冻死且复苏生长较快的单菌株接种于PDA固体培养基平板上，选菌丝较密、生长健壮的单菌株为初筛变异菌株；把初筛变异菌株转接5代，每代都进行0℃、24h耐低温实验，到第5代还保持耐低温性且菌丝较密、生长健壮的菌株为筛选出的最终变异菌株；每个出发菌株选出1株最终变异菌株用以构建基因组重排的突变菌株库；

5)原生质体灭活及融合

将突变菌株库里所有最终变异菌株的原生质体等量混合后分成相等的两份，一份进行热灭活，另一份进行紫外线灭活；将两种方法灭活的原生质体悬液混合，离心收集原生质体，去除上清液后将原生质体悬浮于渗透压稳定剂中，然后加入预热的PEG6000溶液，30～34℃水浴保温60s后加入渗透压稳定剂终止融合，并离心洗涤，去除PEG6000融合剂，洗涤后的原生质体重新悬浮于渗透压稳定剂中，接种于PDA再生培养基上再生培养；

6)菌株4轮重排

原生质体融合后，再生培养3.5～4.5d，收集全部再生菌落接种于PDA固体培养基上32±0.5℃恒温培养3.5～4.5d，然后置于0℃下处理26～30h，再置于32±0.5℃恒温培养，仍然能生长的菌株为F1代重排菌株；将F1代重排菌株全部收集，按上述同样方法制备原生质体、并进行原生质体融合、再生、低温处理，共进行4轮循环，每增加一代低温处理时间增加3～4h，选出每代仍然能生长的重排菌株，分别标记为F1、F2、F3、F4代重排菌株；

7)重排菌株遗传稳定性鉴定

将F4代重排菌株连续转接培养5代，每代都进行0℃、40h低温处理，到第5代还保持耐低温性且生长速度、菌落外观形态、颜色均无明显变化的菌株为遗传性稳定的基因组重排菌株，即为耐低温草菇菌株；

8)出菇实验及分子生物学鉴定

检测重排菌株的出菇性能，选出出菇性较好的耐低温草菇菌株用RAPD法鉴定是否为基因组重排菌株，扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶中电泳120min，紫外灯下观察重排菌株与变异菌株电泳条带是否存在差异；

9)重排菌株耐低温性鉴定

将栽培实验得到的耐低温草菇子实体放在保鲜袋中，于10℃低温条件下储藏，每间隔2h观察子实体有无软化，并切开，观察切面有无水浸现象，当子实体变软，切面出现水浸现象时则失去了商品性。