[发明专利]胚胎干细胞及其培养用饲养层细胞的制备方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种胚胎干细胞及其培养用饲养层细胞的制备方法。

背景技术

为方便说明，本发明所用术语的英文缩写对应如下：

丝裂霉素，MMC；胚胎干细胞，ES细胞；胚胎成纤维细胞，MEF细胞；多聚甲醛，PA；戊二醛，GA；gel，凝胶。

胚胎干细胞（ES细胞）介导的基因操作技术是遗传工程中进行基因改造和遗传修饰的重要技术之一，ES细胞的质量对后续基因操作以及遗传工程小鼠构建的成功率发挥着至关重要的作用，因此ES细胞的培养与分离是遗传工程小鼠技术的关键环节之一。

ES细胞需要培养在其他细胞及其细胞外基质上才能生长良好，这一类辅助ES细胞生长的细胞被称为饲养层细胞。通常情况下使用丝裂霉素C（MMC）处理后的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞）制作饲养层细胞。使用MMC处理后的细胞失去了分裂能力，能维持ES细胞处于未分化状态，此状态对于维持ES细胞的全能性非常重要。

目前，广泛使用的MEF细胞培养方法主要存在如下的不足：

首先，MEF细胞的提取及培养过程很繁琐；ES细胞每次传代时都需要重新制备MEF细胞，且均需要经MMC处理，时间和成本消耗过大。 

其次，MEF细胞是可能的污染源；原代MEF细胞需要直接从小鼠提取，提取过程中容易出现细胞污染，每次ES细胞传代时，都有可能细胞污染引入原本并无污染的ES细胞中。

再次，MEF细胞是ES细胞操作的主要干扰物；囊胚注射之前需要使用蛋白酶消化处理培养于MEF细胞层之上的ES细胞，使之与培养瓶或培养皿分离，在此过程中，很多MEF细胞同时也被消化下来混入样品，干扰后续的显微操作。

目前，有许多研究致力于寻找代替MEF细胞饲养层的ES细胞饲养体系。如使用蛋白或者多聚材料代替饲养层细胞，但是这些方法价格高昂，不易推广。

发明内容

本发明的目的在于利用化学固定的MEF细胞来代替MMC处理的MEF细胞来制备饲养层细胞，能够提供质量稳定的ES细胞，可反复使用，价格便宜，节约了时间和成本，而且饲养层细胞在消化处理时不会随着ES细胞脱落，而且降低了传代次数，降低了受外界污染的几率，减少了对囊胚注射的干扰。

本发明是采用以下技术方案实现的：

所述新型的小鼠胚胎干细胞及其培养用饲养层细胞的制备方法，饲养层细胞采用化学固定的方式制备。

进一步地，所述化学固定采用多聚甲醛（PA）作为固定剂。

或者，所述化学固定采用戊二醛（GA）作为固定剂。

整体培养过程包括如下步骤：

（1）准备注射前将胚胎肝干细胞接种到饲养层细胞上，贴合度达到80%后进行一次传代；（2）注射前1天或注射当天将细胞用酶（一般选用胰酶）进行消化，然后离心收集细胞，吸出上清液后加培养基重悬；（3）冷藏（冷藏温度一般为4摄氏度）或直接注射。

进一步地，步骤（1）中贴合度为80%。

本发明的有益效果在于：

在传统方法中，步骤（1）所述的传代需要进行3次左右，步骤2中所述的工序全部需要在注射当天进行。而经过本发明的改良后，进行1次传代即可，减少了工艺成本，同时，传代过程易于引入污染源，减少传代次数即可降低污染的可能。另外，相比于生物培养法，化学固定法能够提供质量稳定的ES细胞，可反复使用，而且饲养层细胞在消化处理时不会随着ES细胞脱落。

附图说明

图1是未经处理的细胞形态光镜图；

图2是经PA处理的细胞形态光镜图；

图3是经GA处理的细胞形态光镜图；

图4是经MMC处理的细胞形态光镜图；

图5是转录因子表达水平对比示意图；

图6是经PA处理后的细胞悬液光镜图；

图7是经MMC处理后的细胞悬液光镜图；

图8是经GA处理后的饲养层细胞光镜图；

图9是经未经过处理的饲养层细胞光镜图。

具体实施方式

所述新型的小鼠胚胎干细胞及其培养用饲养层细胞的制备方法，饲养层细胞采用化学固定的方式制备。

进一步地，所述化学固定采用多聚甲醛作为固定剂或者，所述化学固定采用戊二醛作为固定剂。

具体地，在经过消毒的器皿上进行细胞接种，接种时可以使用冰的丙酮或酒精作为固定液，同时用磷酸盐溶液作为缓冲及清洗溶液，选用2%-4%的多聚甲醛或戊二醛溶液进行化学固定。

整体培养过程包括如下步骤：