[发明专利]应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法。

背景技术

小鹅瘟（Gosling Plague，GP）是由小鹅瘟病毒（Gosling Plague Virus，GPV）引起的雏鹅急性或者亚急性的败血性传染病。本病主要侵害出壳后30日龄以内的雏鹅及雏番鸭，具有传播快，发病率和死亡率高的特点，死亡率可达90%~100%。1956年，方定一首先在我国扬州发现本病，并于1961年用鹅胚分离到该病毒。1965年后，在匈牙利、德国、荷兰、前苏联、意大利、英国、法国、南斯拉夫、越南、以色列等国家先后报道了该病的存在。目前世界许多饲养鹅及番鸭地区都有本病的爆发和流行。GPV是细小病毒科（Parvoviridae），细小病毒属（Parvovirinae）中的细小病毒（Parvovirus）成员，为无囊膜，单链DNA病毒，直径为20~22nm，是目前已知的动物病毒中较小、较简单病毒之一。鹅细小病毒以肠道栓塞为特征性病变，该病发病急，死亡率高，是危害养鹅业的主要传染病之一。病鹅表现为精神萎顿、昏睡、食欲废绝、排出灰白色或者淡黄色稀粪便、混有气泡、肛门外突，周围被毛潮湿并有污染物。临死前出现两腿麻痹或者抽搐症状。目前小鹅瘟无有效治疗药物，最有效的办法是对健康鹅实施疫苗接种加以预防。

目前繁殖培养小鹅瘟病毒的方法基本上为鹅胚培养法、鸭胚培养法以及转瓶鹅胚原代成纤维细胞培养法。直接采用胚体进行病毒繁殖易受非免疫胚体来源限制，同时采用胚体繁殖病毒，由于培养的病毒悬液中含有大量杂蛋白会给后续疫苗制备带来安全隐患，另外胚体废弃物处理不当也会存在散毒的危险。转瓶原代细胞培养技术虽然比较成熟，但是制备原代成纤维细胞工序繁琐，并且批次间差异较大，培养的病毒量小毒价低，同时也存在胚体源外源病毒污染的生物安全隐患。

近年来，生物反应器和微载体技术培养细胞、繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。与传统的胚体和转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术有着巨大的优势：首先单位体积内有效工作细胞数量增加；其次全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动强度的同时减少人为操作因素影响；再者生物反应器容积的扩大，提高了产品的均一性，也提高了产品的产量和质量；最后生产疫苗所用的成本远低于传统胚体培养工艺与转瓶培养工艺，综合成本大大降低。我国的生物反应器悬浮培养技术起步较晚，但近几年该技术在国内的发展非常快。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法的技术方案，该方法可以缩短生产周期，降低人员配置，污染几率低，占地面积小，并且得到的病毒滴度高，批间差异小。

所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）种细胞的培养：用细胞生长液对种细胞进行培养；

2）繁殖病毒用细胞的悬浮培养：将步骤1）培养得到的种细胞悬浮液接种至灌注袋中，吸附后在生物反应器中加入细胞生长液进行悬浮培养；

3）病毒的培养与收获：将小鹅瘟病毒悬液接种于生物反应器中，换用维持液进行培养，接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近0时，即开始收获病毒，收获病毒后，反复冻融灌注袋，收获全悬病毒液，经检验合格后置于-20℃保存。

所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤1）中种细胞为鹅胚传代细胞系CGBQ。

所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤1）中种细胞采用方瓶培养法、转瓶培养法或微型反应器培养法进行培养。

所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤2）中生物反应器为激流灌注式生物反应器、搅拌式生物反应器或潮汐式生物反应器。

所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤2）中生物反应器的微载体类型为聚酯纤维纸片，使用前用灭菌PBS浸泡过夜。

所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤2）中悬浮培养条件为：温度37～38℃，pH7.0～7.6，溶解氧30%～60%，接种量为3～6×10⁹个细胞。

所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤2）中悬浮培养时根据细胞糖耗情况随时补糖或者补加细胞生长液，确保残糖不低于2g/L。