[发明专利]一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法，还涉及利用该方法所制得的毛状根在枳根系发育研究中的应用。 

背景技术

柑橘是世界重要果树类作物之一。目前，柑橘的研究多集中于地上器官，如花芽分化、果实品质形成机理等方面，而关于地下根系研究的报道极少。根系是果树吸收水分和养分的重要器官，对果树地上部分的生长、发育起着至关重要的作用。由于根系生长于土壤中，观察和取材都极为不便，而离体根器官不能在培养基上培养与继代，这是导致柑橘根系研究较为落后的主要原因。 

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化已广泛应用于柑橘的遗传改良研究（G.A.Moore等，1992.Agrobacterium-mediated transformation of Citrus stem seg ments and regeration of transgenic plants.1Plant Cell Rep,11:238-242）；然而，该遗传转化体系由于存在转化嵌合体、转化率低等问题，从而增加了转化操作的工作量；此外，果树转化再生的周期较长，这也给基因功能鉴定相关的研究带来不便。 

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）同属革兰氏阴性菌。发根农杆菌可侵染具伤口的植物外植体，所含Ri质粒上T－DNA可整合到受体细胞核基因组中；由于Ri质粒T－DNA上含有毛状根发生相关的rolA、rolB、rolC及rolD等基因，此外还含有生长素合成相关的基因，可促使受体组织细胞自发产生毛状根且离体毛状根可以在未添加激素的培养基继代繁殖。发根农杆菌诱导产生的毛状根通常来源于单细胞，不存在嵌合体；同时，已有研究表明发根农杆菌Ri质粒可以驱动外源双元表达载体上T-DNA发生转移，从而与Ri质粒本身T-DNA一起转化到受体细胞，获得共转化毛状根（Wu Jiao等，2012.High-efficiency regeneration of Agrobacterium rhizogenes-induce d hairy root in apple rootstock Malus baccata(L.)Borkh.Plant Cell Tiss Organ Cult,111:183-189.）。 

DR5启动子是人工合成的受生长素诱导表达的启动子，将DR5启动子与GUS或GFP等报告基因重组后可作为植物体内生长素浓度及分布的可视性标记，已成功应用于杨树内源生长素应答和分布的研究中（Chen Yiru等，2013.DR5as a reporter system to stdudy au xin response in Poulus.Plant Cell Rep,32:453-463）。 

枳是柑橘栽培中普遍使用的砧木，关于枳根系发育的研究鲜见报道。本发明的目的是 利用双元载体上含DR5::YFP:GUS的发根农杆菌建立枳毛状根高效诱导与离体培养体系，并以此为基础在枳毛状根体系中进行根系生长和发育过程中的生长素应答模式的研究。 

发明内容

针对柑橘根癌农杆菌转化中存在的嵌合体现象及转化率低，以及柑橘根系研究中存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法，方法易行，操作简便，共转化毛状根诱导频率高，离体毛状根可在MT基本培养基上自主生长，生长条件容易控制，实验观察方便。 

本发明还有一个目的载体提供了一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生的毛状根在根系发育研究中的应用，该毛状根体系因为含有DR5::YFP:GUS报告基因，且DR5启动子受生长素诱导表达，因此可以根据YFP荧光和GUS染色结果直观的观察毛状根生长和发育过程中内源生长素的分布和表达模式；克服了枳根系发育研究常规方法中存在的诸如根系生长在土壤中，观察、取材不便，生长环境难以控制等问题。 

一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法，其步骤如下： 

（1）剥取枳果实种子，1M NaOH浸泡10min去除果胶，蒸馏水漂洗3－5次后3%次氯酸钠消毒20min，灭菌蒸馏水漂洗3次，去掉内外种皮后播种于MT播种培养基，24-26℃暗处培养30-45d获得无菌苗，取出1500－2000lx光照强度下光照5-7d左右，待转绿后挑选健壮无菌苗，将上胚轴切成1.5cm左右切段，待用；