[发明专利]一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法及应用

权利要求书

1.一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法，其步骤如下：

（1）剥取枳果实种子，1M NaOH 浸泡10min去除果胶，蒸馏水漂洗3－5次后3%次氯酸钠消毒20min，灭菌蒸馏水漂洗3次，去掉内外种皮后播种于MT播种培养基，24-26℃暗处培养30-45d获得无菌苗，取出1500－2000lx光照强度下光照5-7d左右，转绿后挑选健壮无菌苗，将上胚轴切成1.5cm，待用；

（2）利用电转化方法将含DR5::YFP:GUS的双元表达载体质粒导入发根农杆菌MSU440，获得含双元载体的发根农杆菌；

（3）挑取活化后的发根农杆菌单菌落，在含50mg/L 壮观霉素的LB固体培养基上划线，28℃暗培养36－48h，用手术刀片刮取培养好的菌体于添加了20mg/L乙酰丁香酮的MT悬浮培养基中，180rpm、28℃振荡培养1.5－2h后将菌液OD₆₀₀值调整至0.6－0.8，待用；

   （4）将无菌苗上胚轴切段转至含发根农杆菌的MT悬浮培养基中，浸泡20－30min，期间轻轻摇匀2－3次；

（5）无菌滤纸吸干多余菌液后转至含20mg/L乙酰丁香酮的 MT共培养培养基中，21℃ 暗处共培养3－4d；

（6）取共培养结束的外植体，灭菌蒸馏水漂洗3次，无菌滤纸吸干后转至含50mg/L卡那霉素及400mg/L头孢霉素的毛状根诱导培养基上, 24-26℃ 暗处培养14d左右可见白色毛状根从上胚轴切段伤口陆续发出；

（7）当毛状根长至2cm，切取1.5cm左右含根尖部分毛状根继代于含400mg/L头孢霉素 MT基本培养基中，20d继代一次，继代2－3次即可获得无菌的毛状根；

所述的培养基配方如下：

MT播种培养基：MT+25g/L 蔗糖+8g/L 琼脂

MT悬浮培养基：MT+0.5g/L麦芽提取物+1.5g/L谷氨酰胺+40g/L蔗糖+20mg/L乙酰丁香酮

MT共培养培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+20mg/L乙酰丁香酮

毛状根诱导培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+50mg/L 卡那霉素+400mg/L+头孢霉素

LB固体培养基：酵母提取物5g/L，胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L；

所述的DR5::YFP:GUS的双元表达载体质粒，其构建过程是：

DR5由7个11bp的5'-CCTCGTGTCTC-3'串联重复组成；内切酶XhoⅠ和NotⅠ酶切SlIAA14：：GUS + YFP载体并回收，将DR5序列用T4 DNA 连接酶连接入回收载体，即构建出DR5::YFP:GUS双元表达载体。