[发明专利]一种采用胎源性组织重建全皮的组织工程方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胎儿种子细胞培养皮肤干细胞的方法技术。属于生物医药领域。 

背景技术

皮肤，是人体最大的器官，它覆盖于身体表面，由表皮、真皮、皮下组织及附属器官组成。皮肤在抵御微生物入侵、紫外线辐射以及防止水分的丢失、调节体温和维持人的外貌等方面起着十分重要的作用。 

皮肤具有极强的修复和再生能力，这与皮肤干细胞的存在具有直接的关系。近年来，具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能的干细胞已经逐渐成为创面愈合修复研究的焦点。目前对于皮肤干细胞的再生方法主要有两种：一种是自体皮肤细胞培养皮肤干细胞；另一种是成人异体皮种子细胞培养皮肤干细胞。前者通常采用患者的自体皮肤，提取分离皮肤种子细胞，经过培养成为皮肤干细胞。后者通常利用男性青少年包皮环切术被切除部分皮肤作为种子细胞培养皮肤干细胞。 

对于自体皮肤细胞培养皮肤干细胞的方法而言，由于其采用的是患者的自体皮肤，因此无排异性，而且易于生长。但是也存在以下缺点：①再生皮肤有瘢痕：由于成人的皮肤组织发育成熟，成纤维细胞及成纤维胶原蛋白丰富，新生皮肤仍无法避免瘢痕生长。②成人细胞生长繁殖力低下，难以满足大面积烧伤病人皮肤缺损的需求。③成人 细胞发育成熟后，细胞相对老化，生长新的皮肤难以实现全皮层生长，一般情况下仅仅满足表皮生长，仅仅起到覆盖作用，皮肤大部分正常功能不能全面复制。 

对于成人异体皮种子细胞培养皮肤干细胞的方法而言，由于其采用的是异体皮种子细胞，因此一般存在以下缺点：①异体排异现象：由于异体细胞存在排异问题，在临床上需要进行抗排异治疗——免疫抑制剂，价格昂贵，终身使用。②瘢痕挛缩：与上述成人细胞移植同理。③来源少，细胞生长力低下，无法满足常规治疗应用。目前并无异体细胞移植无排异、修复无疤痕、细胞生长力强的皮肤干细胞培养方法。 

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提供一种皮肤干细胞的培养方法。特别地，提供一种采用异体细胞培养皮肤干细胞的方法，并且无明显排异性，修复无疤痕，细胞的生长力较强。 

研究发现，胎儿异体细胞移植后并无明显排异现象，而且细胞生长力强。胎儿皮肤在子宫外观察组织被带有正常附件的真皮组织化后，并没有相应的炎症反应，而且组织可以迅速修复并且无疤痕形成。另外，胎儿皮肤无疤修复离开子宫环境也是可行的。 

采用胎儿皮肤细胞进行修复无疤痕的原因应当在于以下几个方面： 

1)组织结构方面：胎儿的松弛细胞外基质(ECM)的存在。 

2)妊娠特定时期：在大多数动物模型包括人，无疤修复在妊娠的 中期到妊娠末三个月之前。 

3)组织成分方面：一方面，胎儿与成体成纤维细胞的胶原成分不同；另一方面：相比较成熟的胎儿和成体皮肤，早期妊娠的皮肤富含透明质酸，纤维调节素，核心蛋白多糖等。 

4)生物活动方面：胎儿成纤维细胞有能够自发的增殖并且合成胶原，这些细胞可以迁移，可能会替代细胞外基质，并直接或间接地刺激宿主组织从而修复皮肤。 

5)免疫功能方面：胎儿治愈没有炎症反应，而疤痕的产生也是炎症反应的一个重要因素。 

6)分子分析：胎儿及成体细胞分泌的细胞因子表达类型及量的不同。 

具体而言，针对上述技术的不足，本发明提供如下的一种技术方案：采用24周以下的人工流产的胎儿的皮肤原代种子细胞，喷涂于三维皮肤种子细胞支架，重建全皮的方法。 

特别地，本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种组织工程全皮重建的方法，包括供体——同种异体组织采集，窗口期检测，建库，皮肤种子细胞分离，分离后种子细胞入库，低温储存，建模，喷涂于三维支架进行皮肤干细胞培养，48小时后进行临床移植。 

特别地，上述方法包括以下步骤： 

步骤1：供体采集 

所述供体——同种异体组织采集，供体为12-24周(自愿主动)人工流产的胎儿。供体采集前，孕妇需进行常规体检及卫生管理部门 规定的血尿常规及生化检测，并按照本方法流程规定的检测项目进行加项检测，包括艾滋病、梅毒、淋病、染色体；对检测符合标准的孕妇，采用常规人工流产术获得胎儿，将取出的胎儿用生理盐水清洗后放入专用营养液，于12小时内送至细胞库进行窗口期检测等生产程序(分离车间)。 

步骤2：窗口期检测 

所述窗口期检测，供体采集完成后，进入实验室前，对供体进行窗口期检测，检测目的：筛查常规临床检测未见的潜伏期疾病，及未致病病毒细菌携带供体，确保供体无污染及潜在隐患后进入实验室； 

步骤3：组织清洗