[发明专利]一种利用L-赖氨酸2-单加氧酶和δ-戊酰胺水解酶催化制备5-氨基戊酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶法制备5-氨基戊酸的方法，尤其涉及一种利用工程菌表达的L-赖氨酸2-单加氧酶和δ-戊酰胺水解酶双酶催化L-赖氨酸制备5-氨基戊酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

5-氨基戊酸是一种重要的平台化合物，作为末端氨基酸的典型代表，可用于制备包括尼龙-5,5（尸胺和戊二胺的共聚物）和尼龙-5（5-氨基戊酸均聚物）在内的多种新型生物材料(Comparison of lamellar crystal structure and morphology of nylon46and nylon5.Polymer,2000.41,8961–8973)。作为C5平台化合物，5-氨基戊酸也可用于合成5-羟基戊酸、戊二酸、1,5-戊二醇和戊内酰胺等重要化合物，在化工领域有着非常广泛的应用。

5-氨基戊酸是恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）中L-赖氨酸代谢的重要中间产物(Identification of the initial steps in D-lysine catabolism in P.putida.J Bacteriol,2007.189,2787-2792.)。已有采用Trichoderma viride来源的L-赖氨酸α-氧化酶催化L-赖氨酸生产5-氨基戊酸的报道（An efficient enzymatic synthesis of5-aminovaleric acid.J Mol Catal B-Enzym2010.65,58-62）。在此过程中，L-赖氨酸经L-赖氨酸α-氧化酶催化生成6-氨基-2-氧代己酸与H₂O₂，6-氨基-2-氧代己酸在H₂O₂的作用下氧化脱羧生成5-氨基戊酸。由于6-氨基-2-氧代己酸的非酶促氧化脱羧受到反应体系中H₂O₂浓度的限制，该系统催化效率较低。

Park等人将恶臭假单胞菌来源的编码L-赖氨酸2-单加氧酶的davB和编码δ-戊酰胺水解酶davA与表达载体pKE112-MCS相连，得到重组质粒pKE112-DavAB，构建到E.coli WL3110中，重组菌分别置于含10克/升L-赖氨酸的LB培养基以及含20克/升葡萄糖和10克/升L-赖氨酸的MR培养基中发酵48小时，5-氨基戊酸产量依次为14.5mM和30.7mM（Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of5-aminovalerate and glutarate as C5platform chemicals.Metab Eng2013.16,42-47）。此方法采用全细胞催化反应体系，5-氨基戊酸产量很低，反应体系复杂不利于后续的分离纯化，且5-氨基戊酸会在胞内其它酶的催化下发生转化。

经检索，利用外源表达的纯化后的L-赖氨酸2-单加氧酶和δ-戊酰胺水解酶双酶催化L-赖氨酸生产5-氨基戊酸的方法未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用外源表达的L-赖氨酸2-单加氧酶和δ-戊酰胺水解酶双酶催化L-赖氨酸生产5-氨基戊酸的方法。

本发明所述利用L-赖氨酸2-单加氧酶和δ-戊酰胺水解酶催化L-赖氨酸制备5-氨基戊酸的方法，步骤是：

（1）将能表达L-赖氨酸2-单加氧酶DavB和δ-戊酰胺水解酶DavA的工程大肠杆菌发酵培养，获得含L-赖氨酸2-单加氧酶DavB和δ-戊酰胺水解酶DavA的工程菌细胞悬液；

（2）对步骤（1）获得的细胞悬液中蛋白进行分离纯化，分别得到L-赖氨酸2-单加氧酶DavB和δ-戊酰胺水解酶DavA；

（3）将L-赖氨酸2-单加氧酶DavB和δ-戊酰胺水解酶DavA作为催化剂与L-赖氨酸水溶液混合，使混合物中L-赖氨酸的浓度为20～40克/升，DavA蛋白浓度为0.1～1.0克/升，DavB蛋白浓度为0.1～1.0克/升；然后在30～42℃、pH6.5～7.5条件下，并以180转/分钟振荡催化反应16～24小时，得含5-氨基戊酸的转化液；

（4）采用异硫氰酸苯酯柱前衍生高效液相色谱法进行5-氨基戊酸的浓度检测，算出产率。

其中，步骤（1）所述能表达L-赖氨酸2-单加氧酶DavB和δ-戊酰胺水解酶DavA的工程大肠杆菌的构建方法是：