[发明专利]一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物病毒的检测方法，具体涉及一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，属分子生物学领域。

背景技术

自1892年Musschenbroek在爪洼首次记述了甘蔗花叶病以来，目前在全世界种植甘蔗的国家普遍发生，并成为甘蔗重要病害之一。感病植株一般出现黄绿相间不规则的花纹、条斑或斑驳，长短、大小不一，布满整个叶片，尤以新叶基部症状最为明显。感病植株叶片黄化，植株矮化，分蘖减少，节间缩短，造成甘蔗产量及蔗茎含糖量降低。引起甘蔗花叶病的病原有3种，即马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus， SCMV）、高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）和马铃薯Y病毒科Poacevirus属的甘蔗条纹花叶病毒（Sugarcane stripe mosaic virus，SCSMV）。根据我们前期研究表明，SrMV是引起我国糖料甘蔗花叶病的主要病原。

甘蔗花叶病的诊断可以通过叶片的病害症状特征来识别，但症状表现与甘蔗品系、生长条件，温度和病毒株系有关，而且有些感病植株没有表现出花叶的症状。寄主范围和外壳蛋白的生化特性能很好的区别马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒亚组不同株系，但是，各种生化和血清学技术很难区分SCMV和SrMV株系。宿主反应是可以用来区分不同病毒株系，但这种方法很耗费时间和劳力。最近，分子鉴定技术常用于研究侵染甘蔗的马铃薯Y病毒科的病毒分类。病毒外壳蛋白（CP）基因序列差异是马铃薯Y病毒科中病毒种的分类标准之一。根据SrMV的CP序列来鉴定侵染甘蔗的SrMV不同分离物国内外已有报道，但是，这种常规分子检测方法需要将PCR产物回收、转化到大肠杆菌DH5α，然后通过测序和序列分析，实验步骤较为繁琐、耗费时间较长。

发明内容

本发明的目的是提供一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，以克服常规分子检测中的不足之处。

本发明的目的是通过以下方法实现的。

本发明的一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，包括甘蔗叶片总RNA提取、简并引物设计、RT-PCR扩增、限制性内切酶反应、电泳检测；其特征在于：

（1）简并引物设计：扩增SrMV不同株系外壳蛋白基因保守序列的简并引物序列SrMV-CPF和SrMV-CPR如下：

SrMV-CPF：5'-ACADCAGADGCAACRGCACAAGC-3'

SrMV-CPR：5'-CTCRCCGACATTCCCATCYAAGCC-3'；

（2）RT-PCR扩增

应用宝生物工程（大连）有限公司反转录试剂盒进行RT反应，反转录反应体系总体积为10 μL，内含：2 μL 5×PrimeScript缓冲液，0.5 μL PrimeScript反转录酶混合液，0.5 μL Oligo dT 引物，2 μL Random 6 mers引物，2 μL 甘蔗叶片总RNA模板，无RNase水补足到10 μL；反转录反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s灭活反转录酶；

随后，应用宝生物工程（大连）有限公司PCR试剂盒进行PCR扩增；PCR反应体系总体积为50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L简并引物SrMV-CPF和SrMV-CPR各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，1.0 μL cDNA，灭菌超纯水补足到50 μL；所述10×PCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl  pH 8.3，15 mmol/L MgCl₂；PCR扩增程序如下：94 ℃预变性2 min、94 ℃变性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃再延伸10 min；

（3）限制性内切酶反应

应用Fermentas公司NsiI和BsmI限制性内切酶进行双酶切反应，酶切反应体系总体积为20 μL，内含2.0 μL 10×酶切缓冲液，4.0 μL 纯化后PCR产物，NsiI和BsmI限制性内切酶各1.5 μL， 灭菌超纯水补足到20 μL；酶切反应条件：37 ℃酶切12 小时；65 ℃处理20 min，终止酶切反应，降至常温；