[发明专利]一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法

权利要求书

1.一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，包括甘蔗叶片总RNA提取、简并引物设计、RT-PCR扩增、限制性内切酶反应、电泳检测；其特征在于：

（1）简并引物设计：扩增SrMV不同株系外壳蛋白基因保守序列的简并引物序列SrMV-CPF和SrMV-CPR如下：

SrMV-CPF：5'-ACADCAGADGCAACRGCACAAGC-3'

SrMV-CPR：5'-CTCRCCGACATTCCCATCYAAGCC-3'；

（2）RT-PCR扩增：

RT反应：反转录反应体系总体积为10 μL，内含：2 μL 5×PrimeScript缓冲液，0.5 μL PrimeScript反转录酶混合液，0.5 μL Oligo dT 引物，2 μL Random 6 mers引物，2 μL甘蔗叶片总RNA模板，无RNase水补足到10 μL；反转录反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s灭活反转录酶；

PCR扩增：PCR反应体系总体积为50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L简并引物SrMV-CPF和SrMV-CPR各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，1.0 μL cDNA，灭菌超纯水补足到50 μL；所述10×PCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl  pH 8.3，15 mmol/L MgCl₂；PCR扩增程序如下：94 ℃预变性2 min、94 ℃变性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃再延伸10 min；

（3）限制性内切酶反应：应用NsiI和BsmI限制性内切酶进行双酶切反应，酶切反应体系总体积为20 μL，内含2.0 μL 10×酶切缓冲液，4.0 μL 纯化后PCR产物，NsiI和BsmI限制性内切酶各1.5 μL， 灭菌超纯水补足到20 μL；酶切反应条件：37 ℃酶切12 小时；65 ℃处理20 min，终止酶切反应，降至常温；

（4）电泳检测：酶切反应结束后取5 μL反应液进行质量体积比为4.0 %的低熔点琼脂糖凝胶电泳，在0.5×电泳缓冲液环境中，80 V稳压电泳2 h，然后用凝胶成像系统观察并拍照，于电泳检测图中出现PCR产物酶切条带，表示该样品含SrMV；不出现PCR产物酶切条带，表示该样品不含SrMV。

2.根据权利要求1所述的一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，其特征在于所述电泳检测，于电泳检测图中，在608 bp和241 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G1株系。

3.根据权利要求1所述的一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，其特征在于所述电泳检测，于电泳检测图中，在849 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G2株系。

4.根据权利要求1所述的一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，其特征在于所述电泳检测，于电泳检测图中，在582 bp和267 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G3株系。

5.根据权利要求1所述的一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，其特征在于所述电泳检测，于电泳检测图中，在414 bp、168 bp、141 bp、126 bp位置出现PCR产物酶切条带，或者在414 bp、267 bp、168 bp 位置出现PCR产物酶切条带，或者在438 bp、267 bp、168 bp位置出现PCR产物酶切条带，或者在438 bp、168 bp、139 bp、128 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示这些样品中含有SrMV-G4株系。

6.根据权利要求1所述的一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，其特征在于所述电泳检测，于电泳检测图中，在606 bp、139 bp、128 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G5株系。

7.根据权利要求1所述的一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，其特征在于所述电泳检测，于电泳检测图中，在843 bp和845 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G6株系。