[发明专利]一种动脉粥样硬化的靶向适配子及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种动脉粥样硬化的靶向适配子，其特征在于：其是采用SELEX方法，通过巨噬细胞源性泡沫细胞筛选同时用平滑肌细胞、内皮细胞以及THP-1细胞反筛选得到的动脉粥样硬化的靶向适配子片段。

2.根据权利要求1所述的动脉粥样硬化的靶向适配子，其特征在于：所述动脉粥样硬化的靶向适配子片段的核苷酸序列为SEQ ID No：1。

3.根据权利要求2所述的动脉粥样硬化的靶向适配子，其特征在于：所述动脉粥样硬化的靶向适配子片段的核苷酸序列为与SEQ ID No：2至少80%同源性的序列。

4.根据权利要求3所述的动脉粥样硬化的靶向适配子，其特征在于：所述动脉粥样硬化的靶向适配子片段的核苷酸序列为SEQ ID No：2。

5.一种如权利要求1所述的动脉粥样硬化的靶向适配子的制备方法，其特征在于采用SELEX方法按照以下步骤进行：

1）建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型；

2）构建FITC标记的随机ssDNA文库；

3）SELEX筛选巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子：利用巨噬细胞源性泡沫细胞筛选，同时用平滑肌细胞、内皮细胞以及THP-1细胞反筛选得到的寡核苷酸适配子；

4）克隆和测序：步骤3）筛选出的寡核苷酸适配子经过PCR扩增，PCR扩增产物纯化之后与pGEM-T载体的连接，然后制作成感受态细胞，用蓝白斑筛选板挑选出白色菌落放入含有2ml氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，进行PCR鉴定，测序，通过荧光显微镜观察，挑选出特异性适配子；

5）适配子与泡沫细胞结合的特异性鉴定：在THP-1细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞源性的泡沫细胞中分别加入上述特异性适配子和酵母tRNA的DPBS液37℃温箱孵育30分钟，去掉上清液后洗涤，荧光显微镜下观察，获取动脉粥样硬化的靶向适配子片段。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤1）中巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立方法是：将THP-1细胞培养于细胞培养板中，用100nmol/L PMA孵育60-84小时，使其诱导分化成巨噬细胞，再用80mg/L oxLDL孵育60-84小时，诱导成泡沫细胞。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于构建FITC标记的随机ssDNA文库的方法是：用生物学方法构建长81nt的随机ssDNA文库，ssDNA文库如SEQ ID No：1核苷酸序列，SEQ ID No：1序列两端为固定序列，中间35个核苷酸为随机序列；设计上游引物SEQ ID No：3和下游引物SEQ ID No：4，上游引物用FITC标记，下游引物用Biotin进行标记，随机ssDNA文库经PCR扩增，PCR产物经琼脂糖电泳、切胶回收后，溶于PBS液中，通过一条带生物素标记的链与链霉亲和素磁珠结合，变性，从链亲和素磁珠上洗脱带FITC标记的链，用盐酸中和后，沉淀过夜，离心并干燥后溶于DPBS液中，即获得FITC标记的随机ssDNA文库。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于其中PCR扩增体系为：ssDNA 模板 0.1ug、10×PCR buffer 10ul、MgCl₂ 2ul、dNTPs 1ul、SEQ ID No：3表示的上游引物50pmol、SEQ ID No：4表示的下游引物50pmol、Taq 酶2U、补加去离子水至100ul；扩增条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性40秒，72℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后，72℃再延伸7分钟。

9.根据权利要求5所述的动脉粥样硬化的靶向适配子的制备方法，其特征在于：其还包括在步骤4）的反应中加入酵母tRNA作为竞争性结合物，每筛选一轮后反筛选一轮。

10.权利要求1所述的动脉粥样硬化的靶向适配子在制备MRI动脉粥样硬化靶向纳米造影剂中的应用。

11.一种MRI动脉粥样硬化靶向纳米造影剂，其特征在于：其包括如权利要求1-4任一项所述的动脉粥样硬化的靶向适配子和载体，所述载体与动脉粥样硬化的靶向适配子连接。

12.根据权利要求11所述的MRI动脉粥样硬化靶向纳米造影剂，其特征在于：所述载体为硅烷包裹的四氧化三铁纳米粒载体；所述动脉粥样硬化的靶向适配子与所述载体中的硅烷以戊二醛作桥梁共价键连接。