[发明专利]一种快速、高效观察山茶属植物花粉管的荧光显微方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物显微技术领域，特别涉及一种快速、高效观察山茶属植物花粉管的荧光显微方法。

背景技术

花粉管荧光显微观察法是利用碱性条件下的低浓度水溶性苯胺蓝染料（苯胺蓝染料中含有荧光色素）浸染植物材料，使吸附于植物细胞的荧光染料经荧光显微镜的紫外光激发，激发光被材料吸收，便产生和释放出荧光，直观地表现出花粉管生长轨迹的方法。

传统的花粉管荧光显微技术，先对植物材料（如花柱或子房）软化，再用苯胺蓝染料浸染处理，通过“盖玻片+材料+载玻片”组合压片后进行荧光观察。传统方法中，植物材料仅仅是被软化，并不透明，而花粉管是在引导组织中生长，观察视线或被遮挡。另外，压片的轻重程度很难拿捏，压片过轻则组织之间重叠，影响观察效果；压片过重，材料破碎，无法真实再现生长轨迹和发育过程，且传统方法多运用于雌蕊细小的植物并只可单面观察，但对于雌蕊较大的山茶属等植物则效果欠佳。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种快速、高效观察山茶属植物花粉管的荧光显微方法。所述方法能够清晰准确的研究山茶属植物有性生殖过程中的生物学事件，同时优化传统方法，获得更好的观察效果。

本发明的观察山茶属植物花粉管的荧光显微方法包括如下步骤：

（1）解剖分离待观察山茶属植物的雌蕊材料至操作单位；

（2）将分离后的材料依次浸泡在NaClO和NaOH溶液中，直到材料透明且软化，再经水溶性苯胺蓝染液染色，采用“双载玻片贴合两面观察法”制片后，进行花粉管荧光显微观察。

其中，步骤（1）为根据山茶属植物雌蕊的结构及观察对象，雌蕊材料的解剖分离分为花柱解剖分离和子房解剖分离。

若所述雌蕊材料为花柱，操作单位是一根独立的花柱；若所述雌蕊材料为子房，操作单位是一列或一个着生在胎座上的胚珠。

花柱解剖分离时，从花柱基部整齐切除子房，得到一根独立的花柱；所述方法适用于刚采集的雌蕊、用酒精保存的雌蕊的花柱的解剖分离。

子房解剖分离时，从花柱基部整齐切除花柱、果柄，留下子房，刮去子房壁，从中轴处切下每个心室，再根据每个心室内胚珠着生的方位继续切分，若胚珠左右对称着生，则从中间对称切开，保证胚珠尽可能多的保留在胎座上，若胚珠不规则着生，则以单个胚珠的方式分离，也尽可能多地保留在胎座上。所述方法同样使用于刚采集的雌蕊、用酒精保存的雌蕊的子房的解剖分离。

其中，步骤（2）中NaClO溶液的有效氯含量为8000-10000mg/L，NaOH溶液浓度为7-9mol/L。

优选地，步骤（2）中NaClO溶液的有效氯含量为9000mg/L，NaOH溶液浓度为8mol/L。

其中，步骤（2）中水溶性苯胺蓝染液质量浓度为0.2-0.3%，用pH为8的磷酸缓冲液配制而成。

优选地，步骤（2）中水溶性苯胺蓝染液质量浓度为0.2%，用pH为8的磷酸缓冲液配制而成。

其中，步骤（2）中透明、软化、染色时使用密闭盖合的容器盛装材料，优选地，所述容器为称量瓶或青霉素瓶。

载玻片厚度为0.8-1.5mm。优选地，载玻片厚度为1.0mm。

其中，步骤（2）中材料先在NaClO溶液中浸泡2-3h，水洗后再在NaOH溶液中浸泡2-3h，水洗后在水溶性苯胺蓝染液中染色6-8h，制片观察并拍照记录。

具体的，步骤（2）为：将分离后的材料经各级酒精复水（50%酒精→30%酒精→蒸馏水），在NaClO溶液中浸泡2h，蒸馏水洗3遍后在NaOH溶液中浸泡2h，蒸馏水洗3遍且流水洗30min后在水溶性苯胺蓝染液中染色6h，制片观察。

其中，步骤（2）中所述“双载玻片贴合两面观察法”进行制片观察的方法为：取一载玻片A，将水溶性苯胺蓝染液染色后的材料置于其上，在材料周围滴加水溶性苯胺蓝染液，取另一规格相同的载玻片B，轻盖于材料上，使两块载玻片处于贴合状态，采用“载玻片A+材料+载玻片B”的组合模式，不经压片，即可观察。

制片时要排净两块载玻片之间染液中的气泡，使染液和材料处于紧密贴合状态。观察时，可先将A载玻片朝上，B载玻片置下观察，随后可反置观察。传统的压片法为“盖玻片+材料+载玻片”组合，此法只可单面观测，不可反置进行两面观察，且压片的力度很难掌握。

优选地，所述山茶属植物为油茶。

本发明所述方法也同样适用于野外“固定液固定-乙醇溶液保存”的山茶属植物雌蕊材料解剖分离及花粉管荧光显微观察。