[发明专利]一种血液DNA的快速提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种血液DNA的快速提取方法，具体涉及一种全血样品DNA的快速提取方法，是分子生物学的最基本的步骤之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组技术等领域。

背景技术

血液DNA的提取和纯化是分子生物学的最基本步骤之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组技术等领域。经典的从血液样品中提取和纯化DNA是分为五个步骤：破碎红细胞、离心沉淀白细胞、破碎白细胞、沉淀去蛋白、分离和纯化DNA。目前常用的血液DNA提取的方法有两个：酚氯仿抽提法和Chelex-100法。前种方法一般可以得到质量和纯化较好的能够长时间保存的DNA，对满足基本的小规模分子实验工作需求已足够，但是这种方法耗时长，不适合大规模的分子临床检验工作，且实验过程所用到的苯酚、氯仿、异丙醇等试剂有毒害。后种方法常用于司法实践中微量DNA的提取，快速简便，但是此种方法得到的DNA模板浓度很低，容易降解，不易长期保存，不能浓缩DNA，对于量少质差的检材提取成功率偏低（杨静开.脱落细胞类DNA提取方法的研究应用[J].刑事技术.2009.(3):54-56），且此种方法很可能会出现下游PCR扩增不均匀，甚至扩增失败。所以这两种方法不易扩大规模，从而影响了后期工作的效率，目前称其为临床基因序列分析研究和应用的瓶颈，许多临床核酸技术的应用受制于快速大量制备血液DNA技术不足。

发明内容

   本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种快速简易、低成本、高可靠性的血液DNA提取方法，推进血液DNA技术推广，最终解决了以上提到的血液DNA提取技术不足问题，并使其可以顺利地应用于规模化的临床实践。我们的目的是用最简便快速的方法制备大量符合品质要求的血液DNA。

    本发明为解决其技术问题，所采取的方法步骤如下：

步骤(1).细胞裂解分离

在全血样本中加入细胞洗涤液，其中全血样本与细胞洗涤液的体积比为5：14，颠倒混匀样本，常温孵育5～10min，期间间偶尔颠倒混一下离心管，13000～16000g转速常温离心1分钟，弃上清，得到残留细胞团；

所述的细胞洗涤液为浓度为20mM的Tris-HCl溶液，pH值为7.6；

步骤(2).消化沉淀

取20～30ul上述步骤(1)所得的残留细胞团，然后依次加入15ul体积分数为10﹪的十二烷基硫酸钠SDS、15ul浓度为8M的醋酸铵、600ul浓度为5M的盐酸胍、3ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，60℃水浴15～30分钟后，冰浴冷却至常温，然后在4～8℃下13000～16000rpm/min转速离心2～3min，得到离心后的上清液，该上清液为DNA抽提液；

步骤(3).纯化

将上述步骤(2)所得的DNA抽提液加入到2ml Eppendorf管中的纯化柱中，常温孵化2～5分钟，充分结合DNA，经纯化柱吸附后，离心分离，得到沉淀物；将沉淀物经硅胶膜洗涤液洗涤两次，离心分离，去除纯化柱中残存的硅胶膜洗涤液，得到洗涤后的沉淀物；然后再洗涤后的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解洗脱DNA后，离心分离，去除沉淀，得到含DNA的保存液；

所述的硅胶膜洗涤液为10mM Tris-HCl、1mM乙二胺四乙酸EDTA、20mM NaCl、体积分数为50﹪乙醇的混合液。

本发明得到的DNA片段长度大于20Kb，OD260/OD280比值大于1.7，可直接用于PCR和其它分子生物学用途。

    本发明有较高的重复稳定性，不需重复实验，在200例志愿者血液DNA提取中，仅一次快速提取即得到高质量的模板DNA，在对EGFR第18、19、20、21号外显子的扩增中，所有提取的血液DNA模板均能成功进行扩增，得到与预计片段大小相同的产物，测序结果也证实了本发明的可靠性。本发明DNA的提取无需经过苯酚、氯仿、异丙醇等有害试剂抽提，可直接迅速取全血样本进行DNA提取。本发明方法具有较高的重复稳定性、操作简单且不耗时、所得DNA质量高的优点。

具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

实施例1.现以正常人血液为例，非限定实施例叙述如下：

（1）取500ul新鲜的全血样本到2.0ml离心管里。离心管中加入1400ul的细胞洗涤液，颠倒混匀样本，常温孵育10min，期间偶尔颠倒混一下离心管。

（2）13000g转速离心1分钟，常温。