[发明专利]用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物及其检测方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种植物病原真菌的检测方法，尤其涉及一种用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物及其检测方法，用于快速、准确地对猕猴桃果实中是否存在猕猴桃软腐病原菌进行检测。 

背景技术

果实采后腐烂是一个全球性问题，在世界范围内新鲜水果贮藏过程中有25%～30%以上因腐烂变质而不能利用。果实采后腐烂原因主要是果实在采后加工、运输、贮存以及销售过程中，由病原菌侵染所致。随着我国水果产业的发展，种植面积的扩大，采后水果腐烂逐步得到重视。但是由于采前病害防治不彻底以及贮运技术的落后，使得采后水果腐烂的情况日益加剧。 

猕猴桃采后贮藏期病害有软腐病、蒂腐病、青霉病，目前鉴定出的病原菌为：Botryosphaeria dothidea、Phomopsissp.、Botrytis cinerea与Penicillium italicum。这些病菌大多通过伤口侵入果实，导致贮运期间果实大规模腐烂，一般发病率在20%左右，严重时能达到50%。其中由于猕猴桃软腐病在贮藏期传染速度极快，潜伏期短，危害也最为严重。Cryptosporiopsis、Diaporthe、Cylindrocarpon、Phoma、Botrytis、Alternaria、Mucor和Sclerotinia等属真菌都曾被报道与猕猴桃软腐病相关，但均未用柯赫氏法则来验证这些真菌是否是猕猴桃软腐病的病原菌。目前只有Phomopsissp.与Botryosphaeria dothidea已被证实是引起猕猴桃软腐病的病原，但Phomopsissp.只能通过伤口侵染猕猴桃，而B. dothidea则可直接从果皮侵入到猕猴桃果实中。由B. dothidea引起的猕猴桃软腐病十分普遍，在中国、新西兰、韩国及日本等国均有报道。猕猴桃果实感染软腐病原菌（B. dothidea）后，发病部位初期呈圆形，病斑中央褐色，病健交界处呈暗绿色。病斑表面无凹陷，用手按压，明显感觉病部果肉变软，果实其他部分组织随着发病进程迅速变软。发病后期病部产生白色菌丝，病部有组织液渗出。剥开皮层可见病部果肉变黄且病健交界处呈水渍状，中间常有乳白色至浅粉红色的锥形腐烂。果实在发病后7～9 d内可导致整个果实完全腐烂。 

由于猕猴桃软腐病发病快，一旦发病则极难防治，容易造成巨大的经济损失。所以，病原的快速鉴定和检测可为病害的正确诊断和早期防治提供参考。传统的检测方法主要依靠菌落形态，发病症状等方法进行，不能快速、准确地检测到病原菌的存在，从而导致病害的误诊和防治延误。虽然利用分子序列比对来鉴定病原物是一种可靠的方法，但从病原菌的培养到PCR扩增产物送出测序以及序列信息返回需要一定周期。这对于传染速度快且危害严重的软腐病来说，需要寻找更加快速准确的方法。利用种特异性引物检测病原菌具有快速、准确的优点，已经为病害的诊断和早治提供了很多成功的事例。 

Ni 和 Yang 等人于2012年发表一对基于内转录间隔区（The ribosomal internal transcribed spacers, ITS）的Fusicoccum aesculi（Botryosphaeria dothidea 的无性态）特异性引物Bd318F/Bd318R，但是使用NCBI基因库的BLAST功能验证引物特异性结果表明，其E value（代表被比对的两个序列不相关的可能性，E value越低，引物特异性越高）高达28，引物特异性非常低。并且Bd318F/Bd318R引物需要巢式PCR反应体系，因此，其便利性差。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物及其检测方法，主要解决现有的技术手段无法快速、准确地检测出猕猴桃中是否存在猕猴桃软腐病原菌的问题。 

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 

用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物，包括一组引物BZY-1和BZY-2，其中，BZY-1为正向引物，BZY-2为反向引物，二者的序列分别如下：