[发明专利]用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物及其检测方法

权利要求书

1.用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物，其特征在于，包括一组引物BZY-1和BZY-2，其中，BZY-1为正向引物，BZY-2为反向引物，二者的序列分别如下：

BZY-1：5′-CCATCAAACTCCAGTCAGTAAACG-3′；

BZY-2：5′- CTGCGCTCCGAAGCGAGATGTATG-3。

2.用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待检测果实样品的DNA；

（2）以待检测果实样品的DNA为模板，配于引物BZY-1、引物BZY-2、2×Taq PCR Master Mix、无菌超纯水混匀并进行PCR扩增，其中，模板DNA、引物BZY-1、引物BZY-2、2×Taq PCR Master Mix和无菌超纯水的容积分别为：0.5～1μL、0.5～1μL、0.5～1μL、12.5μL、9.5～11μL，并且模板DNA、引物BZY-1和引物BZY-2的浓度分别为10～100ng/L、10μmol/L、10μmol/L；

（3）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并根据是否扩增出条带而判定样品中是否存在猕猴桃软腐病原菌。

3.根据权利要求2所述的用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，其特征在于，所述步骤（1）中待检测果实样品的DNA采用CTAB法提取，其提取方式包括以下步骤：

（1a）称取质量为1g、且在-60℃条件下冷冻后的猕猴桃果实样品，放入研钵里并加入液氮研磨成细末，并迅速将该细末转移至10mL的离心管中，同时加入3mL预热至65℃的2×CTAB和10μL 的2-巯基乙醇，混匀；

（1b）将混匀后的产物置于65℃下水浴1h后取出离心管，待冷却至室温后加入等体积的由三氯甲烷和异戊醇混合的混合液，颠倒混匀10min；

（1c）在10000rpm/min条件下离心10min，取上清液移至另一无菌的5mL离心管中，并加入与上清液相同体积的由三氯甲烷和异戊醇混合的混合液轻轻混匀10min；

（1d）在10000rpm/min条件下离心10min，取上清液移至另一无菌的2mL离心管中，并加入与上清液相同体积且已提前在-20℃冰箱中预冷的异丙醇上下颠倒混匀5min后，在-20℃冰箱中静置30min；

（1e）在10000rpm/min条件下离心10min，弃上清液，并加入75%的乙醇浸洗沉淀3min；

（1f）在10000rpm/min条件下离心3min，弃上清液，并加入95%的乙醇浸洗沉淀5min，循环两次；

（1g）在10000rpm/min条件下离心2min，弃上清液，并将离心管置于超净工作台中风干30min后用无菌超纯水溶解DNA。

4.根据权利要求3所述的用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，其特征在于，步骤（1c）中，所述三氯甲烷和异戊醇混合液的体积比为24:1。

5.根据权利要求3或4所述的用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的2×Taq PCR Master Mix由反应缓冲液、0.05u/μL的Taq DNA聚合酶、4mmol/L的氯化镁以及0.4mmol/L的dNTPs混合组成。

6.根据权利要求5所述的用于快速检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的PCR扩增包括以下步骤：

（a）在94℃条件下进行模板DNA的预变性反应，时长为3min；

（b）在94℃条件下进行模板DNA的变性反应，时长为45s；

（c）在66.5℃条件下退火45s；

（d）在72℃条件下延伸1min；

（e）循环步骤（b）～（d）三十次；

（f）在72℃条件下延伸8min。