[发明专利]利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法。

背景技术

细菌人工染色体（BAC）常用来克隆约150kb-300kb大小的DNA片段。由于BAC较大（最大可达300kb），所含5’和3’调控区长，调控元件完全，可以有效的防止一般表达载体基因组整合后出现的位置效应，尤其对启动子及调控序列不十分清楚的高效特异表达基因，优势更为明显，因此BAC也是研究者比较理想的高效特异表达载体。但缺点是BAC较大，分子操作困难，转染细胞效率低。目前BAC大多都是用显微注射的方法进行，这种方法需要单个细胞注射，不适合大量转染，而且操作麻烦，技术要求高。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法，利用pABRG重组质粒对含有目的基因的BAC进行同源重组，然后采用经哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子将重组后的BAC通过核转染技术转染宿主细胞，使重组后的含有目的基因的BAC整合到宿主细胞的基因组中。

具体地，前述方法包括以下步骤：

1）LoxP-eGFP-neo载体的构建：a）用xho和sal双酶切从pPB-eGFP-neo质粒（购自Wellcome Trust Sanger）上切下带有一个Loxp位点和eGFP真核表达调控元件的完整序列，并连接到用xho酶切的PGL3-contro（购自PROMEGA，E1741）载体上，构建成PGL3-loxp-eGFP载体；b）用Bgl和Kpn双酶切PGL3-loxp-eGFP质粒，切下带有Bgl和Kpn粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经Bgl和Kpn双酶切的7zf-mcs上（在PROMEGA公司的pGEM-7zf载体基础上对其克隆位点进行改变，得到7zf-mcs载体），构建成7zf-loxp-eGFP载体；c）用Bgl和not双酶切7zf-loxp-EGFP载体，切下带有Bgl和not粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经BamH和not双酶切的质粒Loxp-F3-neo-F3的骨架上，构建成LoxP-eGFP-neo载体，其全序列如SEQ ID No.1所示。

2）进行第一次重组，即pCC1BAC-Tol2载体的构建：d）将pABRG重组质粒电击转入分别含有3个BAC克隆（编号分别为706H15、169D05和572K17）的电击感受态中，并进一步制备成含pABRG质粒及BAC克隆的电击感受态；e）设计同源臂引物，PCR扩增Tol2转座元件（SEQ ID No.5），电转，进行同源重组；f）鉴定出同源重组正确的阳性菌落，提取BAC，构建得到pCC1BAC-Tol2载体；将所述pCC1BAC-Tol2载体分别标记为706H15-Tol2、169D05-Tol2和572K17-Tol2载体，载体序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6和7所示。

3）进行第二次重组，即质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP的构建：g）设计同源臂，PCR扩增LoxP-eGFP-neo载体中的携带LoxP-eGFP-neo的序列；h）将扩增的PCR片段电击转入含有pCC1BAC-Tol2载体的电击感受态中，进行第二次同源重组；i）PCR和测序鉴定阳性菌落，提取BAC，构建得到质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP；将所述质粒分别标记为706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP，质粒序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.8和9所示。

4）质粒pcDNA3.1-TP的构建：构建得到的质粒pcDNA3.1-TP的全序列如SEQID No.4所示。

5）细胞的转染：用载体706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP、572K17-Tol2-eGFP以及质粒pcDNA3.1-TP共转染绒山羊成纤维细胞。

6）用Cre-LoxP重组酶系统去除遗传标记基因eGFP和抗性基因neo。

前述方法中，转染使用的绒山羊成纤维细胞汇合度为70-80%，细胞数目为0.5×10⁶-1×10⁶个。