[发明专利]利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法

权利要求书

1.一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法，其特征在于，利用pABRG重组质粒对含有目的基因的BAC进行同源重组，然后采用经哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子将重组后的BAC通过核转染技术转染宿主细胞，使重组后的含有目的基因的BAC整合到宿主细胞的基因组中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）LoxP-eGFP-neo载体的构建：a）用xho和sal双酶切从pPB-eGFP-neo质粒上切下带有一个Loxp位点和eGFP真核表达调控元件的完整序列，并连接到用xho酶切的PGL3-contro载体上，构建成PGL3-loxp-eGFP载体；b）用Bgl和Kpn双酶切PGL3-loxp-eGFP质粒，切下带有Bgl和Kpn粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经Bgl和Kpn双酶切的7zf-mcs上，构建成7zf-loxp-eGFP载体；c）用Bgl和not双酶切7zf-loxp-EGFP载体，切下带有Bgl和not粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经BamH和not双酶切的质粒Loxp-F3-neo-F3的骨架上，构建成LoxP-eGFP-neo载体，其全序列如SEQ ID No.1所示；

2）进行第一次重组，即pCC1BAC-Tol2载体的构建：d）将pABRG重组质粒转入分别含有3个BAC克隆的电击感受态中，所述含有3个BAC克隆的电击感受态编号分别为706H15、169D05和572K17，并进一步制备成含pABRG质粒及BAC克隆的电击感受态；e）设计同源臂引物，PCR扩增Tol2转座元件，电转，进行同源重组；f）鉴定出同源重组正确的阳性菌落，提取BAC，构建得到pCC1BAC-Tol2载体；将所述pCC1BAC-Tol2载体分别标记为706H15-Tol2、169D05-Tol2和572K17-Tol2载体，载体序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6和7所示；

其中，Tol2转座元件的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

3）进行第二次重组，即质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP的构建：g）设计同源臂，PCR扩增LoxP-eGFP-neo载体中携带LoxP-eGFP-neo的序列；h）将扩增的PCR片段转入含有pCC1BAC-Tol2载体的电击感受态中，进行第二次同源重组；i）PCR和测序鉴定阳性菌落，提取BAC，构建得到质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP；将所述质粒分别标记为706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP，质粒序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.8和9所示；

4）质粒pcDNA3.1-TP的构建：构建得到的质粒pcDNA3.1-TP的全序列如SEQID No.4所示；

5）细胞的转染：用载体706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP、572K17-Tol2-eGFP以及质粒pcDNA3.1-TP共转染绒山羊成纤维细胞；

6）用Cre-LoxP重组酶系统去除遗传标记基因eGFP和抗性基因neo。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，转染使用的绒山羊成纤维细胞汇合度为70-80%，细胞数目为0.5×10⁶-1×10⁶个。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5）中用载体706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP各5μg以及质粒pcDNA3.1-TP400ng，利用核转染技术转染绒山羊成纤维细胞。