[发明专利]1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒、引物对及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)感染雏鸭引起的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害四周龄以内的雏鸭，具有发病急，传播迅速，病程短和死亡率高等特点；临床主要表现为雏鸭死前发生痉挛，头向背部后仰，呈“角弓反张”，病理变化主要为剖检可见肝脏肿大发炎和大量的出血性斑点，是危害养鸭业的主要疾病之一。目前世界上主要养鸭地区均有本病的存在，具有间歇爆发、地方流行性等特点，主要由属于小RNA病毒科禽肝病毒属的1型鸭肝炎病毒（DHV-1）引起。

1型鸭肝炎病毒（DHV-1），现重新命名为鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV），目前被分为三种基因型（即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3）。目前我国主要流行的鸭肝炎病毒是1型鸭甲肝病毒（DHAV-1）和3型鸭甲肝病毒（DHAV-3），这两种病毒导致的临床症状和病理变化非常相似，但是不具有血清学相关性，对其的传统检测方法包括血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测方法存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性，在临床上常常会因为不能对其及时做出正确的诊断和有效防制而造成巨大的经济损失。

PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速、简便等特点，己经广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于鸭肝炎病毒的检测。但常规PCR技术一次只能检测一种病原物，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需进行多次PCR，不但操作复杂，而且费用较高。多重PCR(Multiplex PCR)技术通过在同一反应管内同时加入多对引物，扩增完成后可同时检测出多种目的核酸片段，满足同时分析不同基因序列的需要，它具有高效快捷、高度特异敏感、降低实验成本、加速实验进程等优点，更适合在临床中应用。一步法RT-PCR即逆转录和PCR在一个共同的体系中进行，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖，有助于减少残余污染，简化了实验操作步骤，所以一步法RT-PCR在处理大量样品时具有明显的优势；而且一步法RT-PCR逆转录所得的cDNA全部用于PCR扩增，故可以得到更高的灵敏度，基于以上特点，一步法双重RT-PCR在临床检测应用中将有显著的优势。

目前已有1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的单一RT-PCR分子检测技术和两步法多重RT-PCR检测技术，但尚未见1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测技术的报道。同时由于鸭甲肝病毒所属的小RNA病毒极易发生基因突变与重组，通过BLAST验证发现已有的检测技术中所提供的检测引物不具有广泛的适用性，不能对众多的1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒毒株进行准确的诊断与分析。本试剂盒中使用的引物通过在1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒基因的相对保守区域设计获得，已通过BLAST验证对比发现其具有更广泛的适用性，同时引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用，同时由于使用该检测试剂盒可以获得包含了1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的全部VP1基因区域的片段，而通过分析1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒VP1基因序列可以对相应病毒进行血清型分析以及相关的抗原性分析，适用于疫源追踪和分子流行病学调查。该检测试剂盒将有利于调查清楚不同地区的鸭肝炎病毒流行情况，从而进行有效的防控，同时也有利于对禽类疾病及时做出正确的诊断，有效治疗和控制而避免造成巨大的经济损失。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能够检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的两个引物对，它们能够分别扩增出包含了1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒完整VP1基因区域的片段。

检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的两个引物对，引物对1由引物1和引物2组成，用于检测1型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为序列表中序列1和序列2所示的单链DNA；引物对2由引物3和引物4组成，用于检测3型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为序列表中序列3和序列4所示的单链DNA；引物对1扩增出的目的片段大小为992bp，引物对2扩增出的目的片段大小为1533bp。

上述引物组中，所述引物1、引物2、引物3和引物4的摩尔比可为1:1:(1-2.5):(1-2.5)，所述引物1、引物2、引物3和引物4的摩尔比具体为1:1:2:2。