[发明专利]1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒、引物对及方法

权利要求书

1.能够检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的两个引物对，其特征在于，引物对1由引物1和引物2组成，用于检测1型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的单链DNA；引物对2由引物3和引物4组成，用于检测3型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的单链DNA。

2.1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，在本试剂盒中包括彼此独立分装的以下各组分：

1.PrimeScript1Step Enzyme Mix    100μl；

2.2×1Step Buffer                   625μl×2；

3.引物1                           （5μM）*100μl；

4.引物2                           （5μM）*100μl；

5.引物3                           （10μM）*125μl；

6.引物4                           （10μM）*125μl；

7.阳性对照                         （30ng/ul）20μl；

8.RNase Free dH₂O                 625 μl×2；

其中PrimeScript1Step Enzyme Mix由RTase、TaKaRa ExHS、RNase Inhibitor以及One Step RT-PCR用稳定剂配制，2×1Step Buffer由Buffer、dNTP以及One Step Enhancer Solution配制，具体配比参照宝生物工程（大连）有限公司的One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)，上述剂量为100次量。

3.应用权利要求2所述的检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的多重PCR检测方法，其特征在于，引物1在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.2umol/L；引物2在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.2umol/L；引物3在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.4umol/L；引物4在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.4umol/L；RT-PCR的反应条件为50℃反转录30分钟，94℃变性2分钟；然后进入变性94℃30秒，45℃梯度退火20秒，每循环一次升高2℃，72℃延伸2分钟的循环，共进行8个循环；然后进入变性94℃30秒，55℃退火20秒，72℃延伸2分钟的循环，共进行25个循环；最后再经72℃延伸10分钟后，于4℃结束反应。