[发明专利]对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因工程制备与鉴定方法

说明书

本发明得到国家973计划项目（2012CB114405）、国家863计划项目（2012AA092205和2012AA10A401）、国家科技支撑计划项目（2011BAD13B04和2011BAD13B07）、天津市自然科学基金项目（10JCYBJC09200）和天津师范大学博士基金项目（52LX18和52LX19）的资助。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin）的基因工程制备和鉴定方法。

背景技术

中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是具有重要食用和营养价值的我国特有经济虾种。近年来频繁爆发的对虾病害问题严重制约着我国水产养殖业的可持续发展，白斑综合症病毒的高度感染性和致死性，以及中国明对虾自身免疫力低下是两大根本原因。突破这一瓶颈的关键在于病害防治、抗病品种培育等理论与实践两方面工作的结合与深入，对虾先天免疫机制的深入研究以及病害防治手段的创新与改进，是解决问题的根本措施，不仅可以为该物种的病害防治、抗病新品种的培育和对虾健康养殖提供理论指导，同时还可以丰富和加深我们对无脊椎动物先天免疫机制的认识，进而为对虾养殖中的病害防治提供新思路和新方法。

丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）是一类重要的蛋白水解酶，广泛存在于动植物及病原微生物中，介导了机体中很多重要的免疫反应，如血淋巴凝结、补体激活、黑化、吞噬、包囊等，而丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor, SPI）作为分子开关调控着这些反应的进程。SPI通过调控SP活力参与蛋白酶级联反应，它作为精确调节SP活力的控制因子，可以防止蛋白酶的过量激活，从而避免宿主自身组织的损伤和破坏。SPI主要存在于血浆或血细胞的颗粒中，共同参与一系列重要的生理功能，包括参与消化作用、受精作用、血液凝结、纤维蛋白溶解、胚胎发育和免疫过程等。节肢动物血淋巴中已经发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可根据其结构特点、结合机制和功能分为四个家族：Kazal家族、Kunitz家族、α-巨球蛋白家族和Serpin家族，甲壳动物中的SPI则主要分属于Kazal和Serpin家族。Serpin家族结构序列高度同源，C-端为反应中心环区（reactive centre loop, RCL），其P1位点决定成员的抑制专一性，靶酶识别的机制为诱导构象改变模型。节肢动物的SPI在免疫调节与防御中发挥着重要作用，例如凝结作用、proPO级联反应、细胞因子激活和对病原的选择消化抑制真菌和细菌蛋白酶的活性等，从而保护机体免受病原微生物侵害。

目前已从多种动物中分离纯化出Serpin型抑制因子，并对其结构和功能做了初步研究。从经细菌刺激的天蛾幼虫血淋巴中分离到的serpin-6蛋白可以选择性的抑制酚氧化酶原激活酶-3（PAP-3），对该基因进行克隆并原核表达后发现，重组的蛋白在体外可以特定的抑制PAP-3并阻断酚氧化酶原激活系统。目前在甲壳动物的serpin的研究中，仅在鲎（Tachypleus tridentatus）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）和斑节对虾（Penaeus monodon）中有相关报道，主要围绕其基因克隆、组织分布、表达特征和初步的活性分析方面。我们在前期研究中，从中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）血细胞中克隆获得一个典型的Serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin），细菌或病毒（WSSV）的感染可诱导血细胞中该基因表达量的显著上调，表明其在先天免疫应答过程中可能发挥着重要作用。

发明内容

本专利在现有技术研究的基础上，将目的基因（Fc-serpin）构建到表达载体后转化宿主菌，进行目的蛋白的诱导表达和纯化复性，最后通过质谱分析对表达产物进行鉴定。利用原核重组表达获得了对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂并对其进行了质谱鉴定，获得的重组目的蛋白为研究对虾serpin型蛋白酶抑制剂基因的免疫学功能和调控机制奠定了基础，也为揭示甲壳动物抗病的分子基础和对虾病害防治药物的开发进行了前期准备。

因此，本发明的一个目的是提供一种重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂，其特征在于该重组的对虾serpin型蛋白酶抑制剂的蛋白分子量约为45kD，纯化复性后得率为0.3g/L培养基。