[发明专利]对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因工程制备与鉴定方法

权利要求书

1.一种重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂，其特征在于该重组蛋白酶抑制剂的蛋白分子量约为45kD，纯化复性后得率为0.3g/L培养基。

2.权利要求1所述重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂的原核重组表达方法，其特征在于它是将对虾Fc-serpin基因与表达载体连接，完成目的表达载体（pCR^?T7/NT TOPO^?TA-Fc-Serpin）的构建，并转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，进行目的蛋白的诱导表达和纯化复性。

3.权利要求2所述的重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂的原核重组表达方法特征在于：

(1) Fc-serpin原核表达载体的构建：

将已知的目的基因Fc-serpin（GenBank注册号：DQ318857）成熟肽区域与表达载体质粒pCR?T7/NT TOPO?TA进行连接，构建重组表达质粒pCR^?T7/NT TOPO^?TA-Fc-Serpin，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞后测序；

(2) 重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析：

利用诱导剂IPTG对含有重组表达质粒的菌体进行不同时间的诱导表达，收集样品进行电泳检测，以确定蛋白的最佳诱导时间；

(3) 重组蛋白的分离纯化及复性：

利用固定金属亲和层析（IMAC）和Ni-NTA技术对目的蛋白进行分离纯化，利用梯度尿素透析法进行蛋白的复性处理；

(4)目的蛋白的质谱鉴定：

将目的蛋白进行切胶、酶解和离子阱质谱分析鉴定。

4.一种用于对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因原核重组表达的特异性引物SPI-f5’-ACGCGGTCTGTTTAGGTG-3’和SPI-r5’-AACTTCTGGCGGTGTCG-3’。

5.对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂在预防治疗对虾常见致病菌的高度感染性方面的应用。