[发明专利]一种利用复合酶提取苜蓿多糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物活性成分多糖的提取方法，具体地涉及一种利用纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶提取苜蓿多糖的方法。

背景技术

苜蓿多糖(Alfalfa Polysaccharides)是从苜蓿茎叶中提取的水溶性多糖，具有多种生物活性。大量试验证明在一定量的剂量范围内，苜蓿多糖可以促进畜禽的生长，提高畜禽机体的免疫力、抗氧化能力和抗病力。此外，苜蓿多糖对治疗高胆固醇、高血糖、动脉硬化以及心肌梗塞也具有一定的疗效作用，更为重要的是苜蓿多糖对机体无毒副作用。基于以上优点，以苜蓿多糖为主的保健品和添加剂将成为新型保健食品和饲料添加剂的重要一员，从而改善人们生活和促进动物的健康养殖。

苜蓿作为一种多年生优质草本豆科牧草，素有“牧草之王”的美称，在世界各国广泛种植，资源十分丰富，为苜蓿多糖的生产提供了充足且廉价的原料。然而，苜蓿多糖的提取工艺尚不完善，目前的提取方法主要为热水醇沉法，通过持续不断的加热，使植物细胞壁软化破裂，多糖溢出。该方法不仅操作时间长，提取率低，而且持续不断的高温加热会破坏多糖结构，降低多糖的生物功能，因此提取工艺亟需改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用复合酶(纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶)提取苜蓿多糖的方法，根据植物细胞壁的组成特点，利用纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶使苜蓿细胞壁破裂分解，有助于多糖浸出。该方法不仅能够降低多糖提取时所用温度，缩短提取时间，节约能源，而且能够显著提高多糖提取效率，适合应用推广。

本发明提供的技术方案，其特征在于包括以下工艺步骤：

1、将风干或烘干的苜蓿草粉粉碎，过40目筛，在索氏提取器上利用石油醚或乙醚进行脱脂处理，直至上清液透明清亮，然后40℃烘干得到脱脂草粉；

2、该方法采用的纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶购买于国药集团化学试剂有限公司，酶活分别为15000U/g、6000U/mg、50U/g。

3、取脱脂草粉，按草粉重量计，加入1.5-2.5％纤维素酶、1.0-3.0％木瓜蛋白酶、1.0-3.0％果胶酶，然后加入60-80倍草粉重量的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH＝3.0-5.0)；

4、置于恒温水浴锅中，温度升高到40-60℃，以后保持恒温，浸提2.0-3.0h，在此期间每隔20min搅拌一次，作用结束后以真空泵抽滤，收集滤液，得多糖提取液；

5、将多糖提取液煮沸5-10min，灭酶活；

6、将多糖提取液用旋转蒸发仪在60℃下浓缩至原体积的1/5，然后加入4倍体积的无水乙醇，4℃条件下沉淀12h；

7、将醇沉溶液在4000rpm/min下离心10min，收集下层沉淀，即苜蓿多糖；

8、溶解多糖沉淀，利用苯酚-硫酸法在490nm下测定多糖含量。

上述方案中所用乙醇为无水乙醇。为了尽可能准确的计算多糖提取率，在提取和抽滤时所用过的容器用蒸馏水洗涤3次，并入多糖溶液。以上步骤中所用的无水乙醇均可蒸馏回收留作下次使用。

本发明通过多次试验，以苜蓿多糖提取率为指标，利用单因素试验依次确定在多糖提取率最大时的提取温度、提取pH值、料液比、提取时间、纤维素酶比例、木瓜蛋白酶比例和果胶酶比例。然后，通过正交试验确定纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶比例的最佳配比。通过响应面试验(中心复合设计)优化提取温度、提取pH值、料液比、提取时间四个因素，从而确定了苜蓿多糖的最佳提取条件，为苜蓿多糖的开发和生产提供依据。

本发明的有益效果是，利用复合酶(纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶)对植物细胞壁进行破裂分解，易于多糖浸出，从而大幅度提高了多糖的提取效率，同时降低多糖提取时间。此外，降低了提取时所用温度，节约了能用的投入。操作简便易行，适合于大规模生产。有利于促进苜蓿多糖作为保健品和饲料添加剂的开发应用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为Y＝f(X₁，X₂)的响应面立体分布图(X₃＝70，X₄＝2.5h)；

图2为Y＝f(X₁，X₂)的等高线图(X₃＝70，X₄＝2.5h)；

图3为Y＝f(X₁，X₃)的响应面立体分布图(X₂＝4.0，X₄＝2.5h)；