[发明专利]三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物及筛选方法

说明书

 

技术领域

本发明属于分子标记技术与应用领域，具体涉及一组三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）微卫星标记的特异性引物及筛选方法，可用于三疣梭子蟹多态性检测和遗传结构分析等领域。

背景技术

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus），属于节肢动物门（Arthropoda），软甲纲（Malacostraca），十足目（Decapoda），梭子蟹科（Portunidae），梭子蟹属（Portunus）。俗名梭子蟹、海蟹或大蟹。三疣梭子蟹广泛分布在中国南北沿海，肉多，味鲜美，脂膏肥满，营养丰富而且生长迅速，养殖利润丰厚，是大型海洋经济蟹类，是沿海重要的渔业资源。开展三疣梭子蟹种质鉴定和遗传结构分析工作，对于三疣梭子蟹的养殖亲本选择、优良品种和家系培育、种资资源的保护具有重要的应用价值。

微卫星标记（Microsatellite）是一种新兴的DNA标记技术，DNA标记技术能够用来作为指纹鉴定或者区分基因组中某种差异特征的DNA段。在基因组水平上，由于DNA核苷酸碱基的突变造成不同的生物个体之间存在着一定的差异，进而造成许多基因组DNA序列的多态性，也就证明了这些序列在不同的个体之间是有差别的。微卫星标记的实质就是基因组中大量存在的短串联重复序列。可以通过已得到的基因序列寻找微卫星序列，然后在微卫星序列的上下游设计特异性引物，这些特异性微卫星引物可以通过PCR技术扩增出微卫星标记条带，通过电泳成像技术对这些条带进行分析。以这些重复序列作为遗传标记的工具，可以进行遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传连锁图谱的构建等一系列工作。

现在微卫星分子已经广泛应用于海洋生物的群体遗传多态性分析、系谱认证、遗传图谱构建等工作中。鉴于微卫星分子标记技术在遗传结构分析中的广泛应用，开发三疣梭子蟹微卫星分子标记具有重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明旨在提供三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物，以及利用该特异性引物进行三疣梭子蟹微卫星标记筛选的方法。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

发明人首先提供了三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物，分别为：

Potr-4:   F: ATGTCCATCGCTTCTAATCA (SEQ ID NO.1)，

R: CGACTCTCTCTCTCTCTCCTGT (SEQ ID NO.2)；  

Potr-20:  F: CGCCTCTCTCTCTCTCTCAG (SEQ ID NO.3)，

R: AAAGGTTATGAAGGGCAGAATC (SEQ ID NO.4）；

Potr-28:  F: CGGAAACTAACCAACTTACCTAC (SEQ ID NO.5)，

R: AGAAAGATAGTGACTTGGTAGCA (SEQ ID NO.6）。

采集三疣梭子蟹活体，提取基因组DNA，通过5′锚定PCR技术获得片段大小在300-800bp的含有微卫星重复序列的基因片段，将获得的目的基因片段与载体进行连接反应后转入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，进行克隆后测序。利用Tandem Repeat Finder (TRF)软件，参数设计如下：按A、T、G、C排列组合的重复单元为2-6个核苷酸，且其最低重复次数分别为6、5、4、3、3，微卫星核心序列的最小长度为12bp，以此标准查找分析所得的序列，获得含有微卫星重复的序列。

利用引物设计软件Primer Premier 5.0在微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物。对于三疣梭子蟹微含有微卫星的片段进行引物设计，其引物设计参数为：(1) 引物长度为18-25bp；(2) GC含量大于40%；(3) 退火温度大于40℃，且正反引物退火温度相差不超过5℃；(4) 预期的PCR产物长度为100-300bp；(5)尽量避免二级结构。