[发明专利]三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物及筛选方法

权利要求书

1.三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物，其特征是所述的特异性引物分别为：

Potr-4:   F: ATGTCCATCGCTTCTAATCA (SEQ ID NO.1)，

R: CGACTCTCTCTCTCTCTCCTGT (SEQ ID NO.2)； 

Potr-20:  F: CGCCTCTCTCTCTCTCTCAG (SEQ ID NO.3)，

R: AAAGGTTATGAAGGGCAGAATC (SEQ ID NO.4）；

Potr-28:  F: CGGAAACTAACCAACTTACCTAC (SEQ ID NO.5)，

R: AGAAAGATAGTGACTTGGTAGCA (SEQ ID NO.6）。

2.一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是首先使用5′锚定PCR技术扩增基因组DNA获得片段大小在300-800bp之间的DNA片段，将得到的DNA片段与载体连接后转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞内，进行克隆后测序；利用Tandem Repeat Finder软件，参数设计如下：按A、T、G、C排列组合的重复单元为2-6个核苷酸，且其最低重复次数分别为7、5、4、3、3，微卫星核心序列的最小长度为14bp，以此标准查找分析所得的序列，获得含有微卫星重复的序列；然后再根据微卫星标记重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物使之成为可用于检测每个个体微卫星标记的特异性引物；最后对利用这些特异性引物检测得到的微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到多态性良好的微卫星特异分子标记，所筛选到的微卫星标记的特异性引物分别为：

Potr-4:   F: ATGTCCATCGCTTCTAATCA (SEQ ID NO.1)，

R: CGACTCTCTCTCTCTCTCCTGT (SEQ ID NO.2)； 

Potr-20:  F: CGCCTCTCTCTCTCTCTCAG (SEQ ID NO.3)，

R: AAAGGTTATGAAGGGCAGAATC (SEQ ID NO.4）；

Potr-28:  F: CGGAAACTAACCAACTTACCTAC (SEQ ID NO.5)，

R: AGAAAGATAGTGACTTGGTAGCA (SEQ ID NO.6）。

3.如权利要求2所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是所述的特异性引物对三疣梭子蟹进行PCR扩增，其中：扩增体系为：总体积20μl，其中含有1×PCR buffer，0.2μM dNTP，1U Taq聚合酶，模板量为50-100ng；PCR反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟，各个引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10°C之间进行优化，直至预期产物清晰单一。

4.如权利要求2或3所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是所述的特异性引物对三疣梭子蟹进行PCR扩增，PCR产物的检测方法如下：扩增得到的产物在用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增特异性后，再用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后再用硝酸银染色方法进行检测，分析确定不同个体的微卫星标记的基因型。

5.如权利要求4所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是所述的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳主要工艺参数为：恒压1000-1500V、功率200W，电泳1-2个小时。

6.如权利要求2所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是筛选获得重复性好、稳定的多态丰富的微卫星标记，其步骤是根据权利要求4中要求的筛选方法利用权利要求1中的特异性引物在至少两个个体中检测到微卫星标记的不同基因型，继续用大量个体检测其重复性和稳定性，同时得到大量个体微卫星标记的基因型信息。