[发明专利]一种酶法生产磷酸肌酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域；更具体地，本发明涉及一种周质表达肌酸激酶的基因工程菌的制备方法、利用渗透休克法提取得到高纯度肌酸激酶的方法以及应用获得的酶液生产磷酸肌酸的方法。

背景技术

磷酸肌酸是人体自身存在的一种物质，主要存在于心肌，骨骼肌，脑等器官和组织。它的生理作用主要有：它对能量物质ATP起到缓冲作用，上述器官和组织在生命活动过程中所消耗的大量ATP由它来补充，以避免ATP供应的波动；它是能量物质ATP分子中高能磷酸基团传递的载体，线粒体所生成ATP分子的高能磷酸基团在细胞浆中向耗能部位传递就是以胞浆中的磷酸肌酸为载体，并通过胞浆中磷酸肌酸——肌酸激酶系统来实现的。现今，磷酸肌酸作为药物已在心脏手术和心肌梗塞等疾病的治疗方面得到广泛的应用。

现有技术中，磷酸肌酸的合成方法包括化学合成和酶法合成。化学合成具有反应条件苛刻、激烈、不易控制，生成产物复杂，污染环境等缺点。酶法则是以肌酸和ATP为底物，在肌酸激酶催化下，专一生成磷酸肌酸。反应方程式如下：

中国专利CN2129203.5采用了兔肌肌肉中提取的肌酸激酶，酶法生产磷酸肌酸。此方法大规模生产则具有以下缺点：大量兔肌的来源限制；动物来源的酶带有TSEs(Transmissible Spongiform Encephalopathies，传染性海绵状脑病)的风险。中国专利CN201210301825.8采用以克隆鼠肌来源肌酸激酶的基因工程菌为酶原，反应条件为肌酸浓度10g/L，ATP7.5g/L，酶用量450U/L(相当于15g菌体)，转化率92%。如果以三磷酸腺苷二钠三水盐分子量599和磷酸肌酸二钠盐四水合物分子量327.15来计算，不计纯化损失，每升反应液可得到产物4.1克。此方法的缺点是鼠肌来源的肌酸激酶，其表达量过低，从而反应需要的菌体用量大(每克产物需要3.75g菌体用量)；反应液中的杂蛋白比例高；反应液底物浓度低，因为底物ATP浓度一旦提高就会上升对杂酶的利用率，从而降低得率；反应后磷酸肌酸的纯化难度大等缺点。

因此，本领域迫切需要开发生产效率高、易于纯化的制备磷酸肌酸的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供生产磷酸肌酸的方法。

在本发明的第一方面，提供一种周质表达和纯化肌酸激酶的方法，所述方法包括：

(1)提供一重组表达载体，其包含一表达盒，所述表达盒包含：周质定位信号肽编码序列，肌酸激酶成熟肽编码序列；

(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌细胞；和

(3)培养(2)的重组大肠杆菌细胞，从而表达肌酸激酶；

(4)利用渗透休克法使菌体细胞周质中的肌酸激酶释放到溶液中，收获肌酸激酶。

在一个优选例中，所述的周质定位信号肽选自：E coli PhoA信号肽，E coli Omp T信号肽，E coli MBP信号肽，E coli DsbA信号肽，Morganella morganii phoC信号肽，Legionella pneumophila subsp.Apyrase信号肽，Erwinia carotovora pelB信号肽；较佳地，上述信号肽的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:8-14所示。

在另一优选例中，上述信号肽的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-7所示

在另一优选例中，所述的周质定位信号肽是Legionella pneumophila subsp.Apyrase信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示或如SEQ ID NO:15～22所示，其核苷酸序列编码SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；最佳地，选用SEQ ID NO：20。

在另一优选例中，所述的肌酸激酶编码序列如SEQ ID NO:23所示。

在另一优选例中，所述的表达盒还包括：启动子和终止子。较佳地，所述的启动子是T7启动子。

在另一优选例中，所述表达盒中，肌酸激酶成熟肽编码序列的3’端，包括：翻译终止子序列。

在另一优选例中，步骤(3)中，表达条件为：37±1℃，220±30rpm培养；当OD₆₀₀达到0.6±0.1时加入IPTG诱导，并降温到20±2℃，诱导培养16±3小时，离心收集菌体。