[发明专利]一种酶法生产磷酸肌酸的方法

权利要求书

1.一种周质表达和纯化肌酸激酶的方法，其特征在于，所述方法包括： 

(1)提供一重组表达载体，其包含一表达盒，所述表达盒包含：周质定位信号肽编码序列，肌酸激酶成熟肽编码序列； 

(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌细胞；和 

(3)培养(2)的重组大肠杆菌细胞，从而表达肌酸激酶； 

(4)利用渗透休克法使菌体细胞周质中的肌酸激酶释放到溶液中，收获肌酸激酶。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的周质定位信号肽选自：E coli PhoA信号肽，E coli Omp T信号肽，E coli MBP信号肽，E coli DsbA信号肽，Morganella morganii phoC信号肽，Legionella pneumophila subsp.Apyrase信号肽，Erwinia carotovora pelB信号肽；较佳地，上述信号肽的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:8-14所示；更佳地，上述信号肽的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-7所示。 

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的周质定位信号肽是Legionella pneumophila subsp.Apyrase信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示或如SEQ ID NO:15～22所示；最佳地，选用SEQ ID NO：20。 

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肌酸激酶编码序列如SEQ ID NO:23所示。 

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，表达条件为：37±1℃，220±30rpm培养；当OD₆₀₀达到0.6±0.1时加入IPTG诱导，并降温到20±2℃，诱导培养16±3小时，离心收集菌体。 

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，利用渗透休克法使菌体细胞周质中的肌酸激酶释放到溶液中的方法是：加入高盐溶液，室温缓慢搅拌，离心，取沉淀；沉淀加入预冷的低盐溶液，缓慢搅拌，离心，收集上清 溶液，其中含有肌酸激酶； 

其中，所述的高盐溶液包括：30±5mM Tris-HCl PH8.0，按照质量比20±4%葡萄糖，1±0.2mM EDTA；低盐溶液包括：5mM±1mM Tris-HCl PH8.0，5mM±1mM MgSO₄。 

7.一种应用权利要求1重组表达和纯化的肌酸激酶生产磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述方法包括： 

以三磷酸腺苷和肌酸为底物，利用权利要求1重组表达和纯化的肌酸激酶为催化剂进行反应，反应初期调节pH9±0.2，1±0.2小时后调节pH10±0.2，再过1±0.2小时后调节pH10.5±0.2，反应总时间3±1小时。 

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，底物三磷酸腺苷含量为10-100mM，肌酸含量为20-300mM，肌酸激酶的加入量为500-10000U/L，反应温度25℃-45℃。 

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，底物三磷酸腺苷含量为20-80mM，肌酸含量为50-250mM，肌酸激酶的加入量1000-9000U/L，反应温度30℃-40℃。 

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，反应体系中还包括： 

镁离子，浓度为20-250mM；和/或 

甘氨酸，浓度为3-30mM。