[发明专利]一种杂交辣椒种子纯度检验的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂交辣椒种子纯度检验的方法，特别是一种利用辣椒种子中含有的贮存蛋白质进行纯度检验的方法，属于蔬菜种子质量检验领域。

背景技术

辣椒是重要的蔬菜栽培品种。我国既是辣椒的起源中心之一，也是辣椒栽培和消费大国。辣椒制种主要采取人工去雄授粉和不育系直接授粉两种方式，不育系制种只能用在尖椒×尖椒；尖椒×甜椒，甜椒×甜椒却采用人工去雄授粉的制种方法。由于受气候和制种户管理水平以及人为等因素的影响，人工去雄授粉的制种方法造成很大一部分辣椒种子的纯度低于国家标准要求。

目前，国标上通用的种子纯度鉴定方法为田间种植鉴定和室内分子、蛋白质检验。国外知名公司多采用室内分子特异性标记方法，中国企业则通用反季海南种植鉴定。由于田间种植鉴定的周期长，成本高，受自然气候条件的影响也较大，因而不能适应当年种子销售的需求，致使多采用库存种子隔年销售的办法。室内分子特异性标记办法对机械设备和操作人员的技术要求则较高，特别是一个产品需要筛选一个特异引物，这对中等以上规模的蔬菜公司来说，是难以办到的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够利用辣椒种子贮存蛋白，简捷、快速、准确的对辣椒种子进行纯度检验的方法。

其技术方案是：一种杂交辣椒种子纯度检验的方法，其特征在于按下述步骤操作：

1）种子贮存蛋白提取液的提取：

A.将种子在丙酮溶液中浸泡5-6个小时脱脂处理后，取出晾干；

B.将种子单粒切成三块后放入离心管中并加入90ul的提取液；

所述提取液为由0.58gNaCL+20g蔗糖+蒸馏水制成100ml的溶液；

C.在5℃条件下放置12小时，提取上清液，即得种子贮存蛋白提取液；

2）置板、灌胶：将垂直板电泳槽玻璃板两侧用凡士林密封，加热琼脂糖封住底部；玻璃板之间加入22ml的分离胶；分离胶凝固后，再加入6ml的浓缩胶，插入样品梳；

所述分离胶由分离胶母液、分离胶缓冲液、Vc-FeSO₄溶液、水、过硫酸铵溶液按28ml：3ml:4ml：6ml：1.2ml构成；

所述浓缩胶由浓缩胶母液、浓缩胶缓冲液、Vc-FeSO₄溶液、水、过硫酸铵溶液按3.5ml：2.5ml：3ml：2ml：1.2ml构成；

所述分离胶母液为19.0g丙烯酰胺+0.76g甲叉双丙烯酰胺Bis+蒸馏水制成100ml的溶液；

所述分离胶缓冲液为PH3.2的1.647gNaCl+13.5ml乳酸+蒸馏水制成100ml的溶液；

所述浓缩胶母液为16.9g丙烯酰胺+2.13g甲叉双丙烯酰胺Bis+蒸馏水制成100ml的溶液；

所述浓缩胶缓冲液为1.714gNaCl+3.5ML乳酸+蒸馏水制成100ml的溶液；

所述Vc-FeSO₄溶液为0.48gVc+8mgFeSO₄+7H₂O+蒸馏水制成100ml的溶液；

所述过硫酸铵溶液为过硫酸铵1.141g+蒸馏水制成100ml的溶液；

3）浓缩胶凝胶后，拔去样品梳，每孔注入15ul的种子贮存蛋白提取液点样；

4）电泳：点样结束后，电泳采取稳流法和甲基蓝指示剂：电泳电流单板不超过50mA；

5）：取胶：甲基蓝指示剂全部跑出分离胶后结束电泳，取下胶片，切除浓缩胶及分离胶非有效观察区的部分，撬出一层分离胶；

6）染色：将撬出的一层分离胶置于1.4%浓度的考马斯亮蓝8ml+10%浓度的三氯乙酸400ml构成的染色液中进行染色至谱带出现；

7）条带清晰后，将分离胶清洗干净，采用常规方法制作干胶片，即获样品电泳谱带；

8）受检种子纯度检验：用上述方法分别获取标准电泳谱带和受检样品电泳谱带，将受检样品的电泳谱带与标准电泳谱带进行对照比较，即得受检样品种子的纯度。

其有益效果是：本发明根据种子贮存蛋白质具有特异性和遗传性的特点，通过本发明的方法对苏椒五号（江苏省农科院）、中椒106（中国农业科学院）、汴椒一号（开封市红绿辣椒研究所）、美椒八号（本公司）泡椒类型的辣椒品种进行纯度检测，其室内检测结果与田间鉴定的结果高度吻合。具体见下表：

室内蛋白质鉴定与田间鉴定比较表