[发明专利]一种检测生物大分子的磁共振免疫传感方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测生物大分子的方法，尤其涉及一种利用聚苯乙烯微球作为免疫亲和载体进行待测生物大分子富集并直接参与磁共振免疫反应的传感检测方法及相关试剂制备与使用方法。

背景技术

传染性的植物性致病菌和动物性病毒是出入境检验检疫工作中重点监控对象，对这些传染性的有害物进行及时、准确、便捷的检测，对保护人类健康及生命安全、保障国门安全、维护社会稳定具有重要的意义。

目前检测该致病菌和病毒的检测方法主要包括分离培养检测、免疫检测、分子生物学等方法。分离培养方法简单、易行，但由于其检测灵敏度低、耗时长，无法达到检疫要求。免疫分析法具有简单、快速、成本低等优点，适合于大规模样品筛查，但其灵敏度比较低，因此其使用也受到一定的限制。分子生物学方法检测灵敏度较高，特异性较好，但需要昂贵的仪器和较高的专业技术，因此其应用受到一定限制。因此，口岸检验检疫急需建立一种快速、灵敏检测致病菌和病毒的方法。

超顺磁纳米颗粒(Superparamagnetic particles，SMP)是20世纪80年代出现的一种新型纳米磁性材料，因其比表面积大以及在外界磁场下可定向运动，在免疫分离分析、核酸分离与杂交、靶向给药、核磁共振成像等领域到了广泛应用。J Perez等发现SMP在水溶液中当其状态(分散或者聚集)变化时会引起磁场均匀性发生改变，进而显著引起周围水分子质子的横向弛豫时间(T₂)发生改变。SMP经表面修饰，偶联上相关抗体/抗原或给体/受体后即可制备成特异性的磁弛豫时间传感探针(Magnetic relaxation switches，MRS)，通过特异性亲和反应，使体系中分磁颗粒的状态发生改变，由于状态改变的程度与目标分子含量相关，通过弛豫时间的改变可间接得到目标分子的含量。目前，基于SMP的MRS传感技术具有处理简单、快速、灵敏、无损、适于现场检测等优点，在生物分子间相互作用研究、大分子/小分子目标物分析等方面得到了应用。研究表明在MRS体系中，通过增加检测物的免疫结合位点的方式可以使磁探针状态的改变量增大，从而提高方法的检测灵敏度。

免疫亲和富集技术具有的选择性好、富集效率高和分离速度快等优点，在样品前处理中得到了广泛的应用。由于纳米颗粒的比表面积大，且具有良好的生物相容性和稳定性，因此常作为载体用于免疫亲和体系。当这些纳米颗粒偶联上抗体之后，可以从复杂的生物或者环境样品中提取和富集待测目标物。SMP因其独特的磁分离优势，在免疫亲和富集方面已得到广泛应用。然而，基于磁共振弛豫时间传感原理的检测方法，SMP是构成传感探针MRS的中心单元，其状态的改变(分散或聚集)可直接主导周围水分子质子的弛豫时间改变，因此SMP不宜作为待测生物大分子亲和富集的载体，需要找到一种新的免疫亲和载体。

通常，磁共振弛豫时间传感免疫分析方法系在均相水溶液或悬浮液体系中进行。考虑到聚苯乙烯(Polystyrene，PS)微球密度小(与水接近)，分散性好，胶体性质稳定，悬浮性好等特点，本发明提供一种用PS微球作待测组分富集载体用于样品前处理和磁共振免疫传感检测的方法。一方面简化了样品前处理步骤，提高了分析速度，并通过样品特异性富集而提高了检测灵敏度；另外一方面，所使用的PS微球与磁共振弛豫时间免疫传感方法兼容，通过载体上捕获到的抗原(Ag)与MRS磁探针上的抗体(Ab)发生特异性反应，形成以PS微球为中心的网状结构，即克服了免疫反应通常面临的空间位阻问题，又增加了反应结合位点。上述两方面作用，使磁共振免疫反应中MRS状态的改变程度增大，从而显著提高了检测灵敏度。同时，样品前处理步骤简单，分析速度加快。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快速、灵敏检测生物大分子(细菌和病毒)的磁共振弛豫时间免疫传感分析方法。采用本发明的方法，用PS微球作为免疫亲和载体，在样品前处理中进行生物大分子Ag的快速提取、富集，同时将PS微球捕获到的Ag与检测体系中MRS上偶联的Ab进行特异性免疫反应，使用低场磁共振分析仪，实现了生物大分子灵敏、简便、快速检测，克服了目前分子生物学检测方法操作复杂、免疫检测方法灵敏度低等缺点。

利用PS微球作为富集载体的检测生物大分子的磁共振免疫传感方法，其分析步骤如下：

1.复合富集试剂(PS-Ab)(1)的制备

1.1磷酸盐缓冲溶液的配制：磷酸氢二钠(0.2M)和磷酸二氢钠(0.2M)按照一定量的比例混合，配制成0.01M磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.0-7.4。