[发明专利]温敏性固定化木瓜蛋白酶及其在制备单克隆抗体中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种温敏性的固定化木瓜蛋白酶，及其在制备单克隆抗体中的应用。

（二）背景技术

单克隆抗体（Monoclonal Antibody）是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体。它的理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使单克隆抗体一问世就受到高度重视，并成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。

尽管单克隆抗体其在疾病的诊断、治疗等方面有着明显的优势，但是，常规单克隆抗体应用也具有明显的局限性，主要体现在其抗原性以及分子结构的大而复杂性，前者易产生治疗中的排异等副作用，后者造成其组织的穿透力差，特异性低，表达复杂且困难。抗体Fab或F(ab’)₂片段由于去掉了抗体恒定区(Fc)，免疫原性及分子量大大减小，穿透性强，同时还能保留对原抗原的结合能力，因而药物动力学性质得到改善，更有利于临床应用。此外，在许多生物制药的研发工作中往往需要使用某个单克隆抗体片段而不是整个免疫球蛋白分子。

目前单克隆抗体片段常用酶解法制备获得。木瓜蛋白酶（EC.3.4.22.2）是一种半胱氨酸肽链内切酶，被广泛用于抗体片段的制备。用于酶解反应的木瓜蛋白酶有游离及固定化两种状态。用游离酶消化抗体，虽然游离酶的酶活力高，但是在水解过程中不易与产物分离，不利于后续的产物纯化，而且反应较难控制，酶也难于重复利用。随着固定化技术的发展，人们逐渐将固定化的木瓜蛋白酶应用于抗体水解领域。现阶段使用的固定化酶均为固相化，此类固定化酶虽具有固定化酶的易于与底物、产物分离，在较长时间内重复利用，多数情况下稳定性提高，酶反应过程能加以严格控制等优点，但在水中扩散限制大，催化效率低下。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种温敏性的固定化木瓜蛋白酶，及其在制备单克隆抗体中的应用。该材料固定化木瓜蛋白酶在常温下溶于水形成均相，当温度超过其最低临界溶解温度时便固相析出，以此为载体制备的固定化酶具有了热应答性质，将传统固定化可重复利用等优点及可溶性酶较少扩散限制等优点结合在一起，具有较好应用前景。

本发明采用的技术方案是：

一种温敏性的固定化木瓜蛋白酶，由如下方法制备得到：

（1）将DMF（二甲基甲酰胺）用分子筛干燥，温敏性载体溶于干燥过的DMF中，温敏性载体与DMF的比例是1g：1～10mL，得到载体溶液；所述温敏载体为N-羟基琥珀酰亚胺酯封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺），平均分子量为2000，其结构式为如下：

（2）将木瓜蛋白酶溶于pH7.5～10.0的硼酸盐缓冲液中，调酶液浓度至1～10mg/mL（≥10U/mg），得到酶溶液；

（3）将载体溶液与酶溶液混合，于4～55℃反应1～8h，反应液用pH7.5～10.0的硼酸盐缓冲液稀释；

（4）40℃空气浴中，11000r/min离心20min，除去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，再于相同条件下离心；

（5）重复步骤（4）的操作2～3次，最后所得沉淀溶于新配的磷酸盐缓冲液中，4℃保存，即得温敏性的固定化木瓜蛋白酶溶液。

本发明还涉及所述的温敏性的固定化木瓜蛋白酶在制备单克隆抗体片段中的应用。

具体的，利用本发明温敏载体固定化木瓜蛋白酶制备抗体片段的方法如下：将温敏性的固定化木瓜蛋白酶溶于含有保护剂（5mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA）的pH为4.0～9.0的磷酸盐缓冲液中，20～45℃水浴放置30min，取出。抗体用相同的缓冲液透析后，调浓度为1～10mg/mL，加入固定化酶液，酶与抗体的比为1:1～20（m:m），20～45℃水浴振荡，消化1～22h。然后40℃，11000r/min离心20min，上清即为消化后的抗体片段，沉淀（固定化酶）用磷酸盐缓冲液溶解，用于下一次抗体片段的制备。所得的抗体片段混合液采用蛋白A-蛋白L亲和层析法纯化，得到高纯度的单克隆抗体片段。蛋白A为金黄色葡萄球菌的表面蛋白，分子量为42KD，有6个不同的IgG结合位点；蛋白质L是一种来源于细菌大消化链球菌（Peptostreptococcusmagnus）的免疫球蛋白结合蛋白，与主要通过免疫球蛋白Fc区域（例如，重链）结合的蛋白A和蛋白G不同，蛋白质L通过与轻链发生相互作用而与Igs结合。