[发明专利]一种家蚕抗菌肽attacin2及其异源表达和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，并涉及一种具有抑菌作用的家蚕抗菌肽attacin2。更具体地，本发明涉及一种在原核生物中异源表达的家蚕抗菌肽attacin2、编码该抗菌肽的基因序列、包含该基因序列的原核表达载体以及该抗菌肽在抑制细菌生长中的应用。 

背景技术

抗菌肽是一类天然小分子多肽。近年来，研究者普遍认为抗菌肽最有可能成为现有抗生素的替代品，这是因为其在具有广谱抗菌作用的同时并不会诱导细菌产生耐药性。抗菌肽最早发现于昆虫体内，随后在植物、真菌和其他动物中也相继发现存在抗菌肽。目前，家蚕体内已发现并报道的抗菌肽包括cecropin、moricin、attacin、gloverin、defensin、enbocin和lebocin。 

attacin又称攻击素，是一类富含甘氨酸的抗菌肽，分子量通常为20KD左右。研究表明，attacin主要对革兰氏阴性细菌有较强的抑菌作用，可以广泛应用于医学领域。家蚕被外源细菌感染后诱导所产生的抗菌肽attacin的含量较少，很难从家蚕体内直接分离纯化。因此，只有通过异源表达才能获得大量的家蚕抗菌肽attacin。 

常用的异源表达方式有酵母表达、细胞表达和原核表达，其中原核表达的方法因操作简单、耗时短且表达量高等得到最为普遍的应用。但现有技术中尚缺少有关如何通过异源表达制备家蚕抗菌肽attacin2的方法。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中难以从家蚕体内直接分离 得到家蚕抗菌肽attacin2且尚不存在家蚕抗菌肽attacin2的异源表达方法的缺陷，提供用于异源表达家蚕抗菌肽attacin2的基因、原核表达载体和表达菌株，从而实现家蚕抗菌肽attacin2的量化生产。与此同时，本发明还提供采用异源表达方法制得的家蚕抗菌肽attacin2及其在抑菌细菌生长方面的应用。 

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种家蚕抗菌肽attacin2的编码基因，其碱基序列如SEQ ID No:1所示。 

优选地，对所述编码基因进行PCR扩增使用的引物序列为： 

attacin2-28a-F：5’-CAT GCC ATG GGC CAA GCC GGC AGC TTC ACA GT-3’ 

attacin2-28a-R：5’-CCG CTC GAG TTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GAA GAA TTT AGA GAA GGA GA-3’。 

根据本发明的另一方面，提供一种家蚕抗菌肽attacin2的重组载体，该重组载体包含如SEQ ID No:1所示的家蚕抗菌肽attacin2的编码基因。 

根据本发明的另一方面，提供一种含有重组载体的BL21菌株，该重组载体包含如SEQ ID No:1所示的家蚕抗菌肽attacin2的编码基因。 

根据本发明的另一方面，提供一种家蚕抗菌肽attacin2，其具有如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列。 

优选地，所述家蚕抗菌肽attacin2为成熟肽，所述成熟肽的家蚕抗菌肽attacin2的N端包含6个组氨酸构成的检测标签。 

根据本发明的另一方面，提供一种异源表达家蚕抗菌肽attacin2的生产方法，该方法包括以下步骤： 

获取家蚕抗菌肽attacin2的编码基因； 

构建重组载体：将家蚕抗菌肽attacin2的编码基因的PCR扩增产物连接到pMD18-T克隆载体中，构建得到重组质粒pMD18-attacin2；分别酶切重组质粒pMD18-attacin2和原核表达载体pET28a，构建得到包含家蚕抗菌肽attacin2的编码基因的重组载体pET28a-attacin2； 

表达家蚕抗菌肽attacin2：将重组载体pET28a-attacin2转化至BL21菌株中，利用IPTG诱导后收集包含家蚕抗菌肽attacin2的细菌。 

优选地，所述方法还包括： 

破碎BL21菌株，采用尿素溶液处理离心破碎后的细胞菌液，随后离心并收集沉淀，获得的上清加样于组氨酸蛋白纯化柱上，洗脱后获得纯化的家蚕抗菌肽attacin2； 

以及纯化的家蚕抗菌肽attacin2经PBS透析复性，并经冷冻干燥制得粉末态的所述家蚕抗菌肽attacin2。