[发明专利]K99-987P-F41重组蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物分子生物学和基因工程领域，涉及一种K99-987P-F41重组蛋白及其应用。

背景技术

产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是犊牛腹泻最常见的原因，通常引起牛、猪等动物急性腹泻。ETEC主要作用于空肠、回肠，尤其是回肠。ETEC的毒力因子包括黏附素（也称菌毛）和肠毒素。ETEC的致病机制是特异性菌毛和宿主小肠粘膜上皮细胞特异性受体结合，进而定植于小肠粘膜，防止其因肠道蠕动和肠内容物流动作用而流失，ETEC在肠道内大量繁殖，分泌肠毒素。肠毒素可导致小肠粘膜细胞分泌功能增强和吸收功能下降，使肠道内潴留大量水分和电解质，导致腹泻。ETEC通常可以通过感染的牛进入环境，并使出生的犊牛致病。通常会有一些犊牛会获得天然的免疫保护，然而，在近代畜牧环境条件下，这种保护作用通常不能够保护犊牛，甚至犊牛感染率升高。由于新生犊牛抵抗外界病原感染的能力相对较弱，ETEC发病急死亡快还来不及治疗，对于转慢性的病牛可应用抗生素进行治疗，但是临床上药物使用不规范或者长期用药，导致ETEC耐药性增强或者出现耐药菌株，临床治疗效果不显著，并且增加了治疗费用。需要开发出有效的疫苗进行预防。同时ETEC也是一种人兽共患病原，能够引起新生儿腹泻，因此做好犊牛大肠杆菌病的防制，也具有重要的公共卫生意义。

K99、987P和F41是产肠毒素大肠杆菌三种重要的黏附素，下面对这三种黏附素做详细说明

（1）K99：1972年，Smith和Linggood首先报道了从腹泻犊牛和羔羊中分离到了大肠杆菌K99黏附素。在电子显微镜下，提纯的K99粘附素负染电镜观察呈杆状微丝结构，并具有很强的聚集倾向。SDS-PAGE电泳中，它呈现一条分子量约为18ku的蛋白条带，经测定其等电点为9.75。K99见于牛、羊、猪源性ETEC，粘着仅限于年幼动物的小肠后段，具有甘露糖抗性和凝血活性。菌毛类型F5（K99）介导ETEC特异性地粘膜在牛犊、羊羔和仔猪肠粘膜表面。K99黏附素的生物合成中所涉及的基因已被克隆，并位于一个87.8kb的非接合质粒上，这个质粒还可以编码ST和一些抗生素抗性基因。K99菌毛的合成需要8个独特的蛋白质的表达：fanA～H。fanC，主要亚基和免疫原性多肽的K99菌毛是最高度的表达K99基因。结果表明，一些ETEC K99+菌株检测出K99的表达量是可变的。因此，使用Minca培养基，可以提高K99鉴别率。这些实验表明，葡萄糖抑制K99表达。出现几种细菌毒素的合成受到葡萄糖抑制，包括大肠杆菌热稳定肠毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A、B和C。加入外源性的环状磷酸腺苷（cAMP）可以使热稳定的产肠毒素的大肠杆菌克服葡萄糖介导抑制热稳定肠毒素合成。但是，外源性cAMP不能够使K99大肠杆菌克服葡萄糖介导的K99抑制现象。除了葡萄糖介导的调控，K99的表达和检测也受到其他机制调控。例如，结果发现，在接种平板前通过增加ETEC在液体培养基中有氧生长，可以提高K99+ETEC中K99检出率。

K99+菌株最近从临床标本中分离通常不会出现在体外合成K99；然而，在液体培养基中传几代后，K99是可检测的。出现在液体培养基结果与荚膜突变体相关。推测粘液囊掩盖了一些ETEC K99，因此，荚膜突变体检测K99更适合。K99的表达也依赖于细胞生长的温度。在18℃时，大肠杆菌细胞内可以表达K99菌毛，而在37℃则不表达，也不表达其他菌毛。K99菌毛与细胞结合需要一个受体，即N-羟酸GM3，它位于小肠内的宿主细胞中，这个部位是细菌繁殖和分泌毒素场所，当K99菌毛与受体结合后导致腹泻。当ETEC宿主细胞的附着被抑制，细菌不能够积累在肠道中，则不引起疾病。

（2）987P：1976年Nagy等发现987P黏附素。在电子显微镜下观察，直径为7nm，长度2～4μm左右。形态学上与I型菌毛十分相似，是一种长而坚硬的丝状物，呈中空结构。其蛋白质亚单位的分子量约为18.9ku，纯化抗原在SDS-PAGE电泳中只出现一条分子量约20ku的蛋白带，等电点为3.7。987P不具有血凝活性，该菌毛在体内和体外均可吸附于小肠上皮细胞和刷状缘，不被甘露糖抑制。在实验室保存中容易丢失。987P见于某些牛、猪源性ETEC，粘着限于年幼动物的小肠后段上皮细胞。