[发明专利]一种生产β-D-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产β-D-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobias，CB或β-G）和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。

1837年Liebig和Wohler[1]首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。该酶在自然界中的分布广泛，在植物的种子和微生物中尤为普遍，在动物和真菌体内也发现该酶的存在。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candidapeltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝、猪小肠等。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产β-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用。

本发明提供的重组菌为将编码SDGBGL蛋白的基因导入大肠杆菌得到的重组菌；所述SDGBGL蛋白为如下（a）或（b）或（c）：

（a）序列表的序列1自N末端第20-775位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由（a）或（b）衍生的蛋白质。

所述编码SDGBGL蛋白的基因可为如下（1）或（2）或（3）或（4）所述的DNA分子：

（1）序列表的序列2自5’末端第58-2328位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2所示的DNA分子；

（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白的DNA分子；

（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

所述编码SDGBGL蛋白的基因可通过重组表达载体导入所述大肠杆菌。所述重组表达载体具体可为将所述编码SDGBGL蛋白的基因导入pEASY-E1载体得到的重组质粒。

所述大肠杆菌可为大肠杆菌Rosetta(DE3)。

本发明提供的菌株SDGBGL，是在Escherichia coli Rosetta(DE3)中导入含有目的蛋白的编码基因的重组质粒得到的，已于2013年05月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7630。

本发明还保护以上任一所述的重组菌在制备β-葡萄糖苷酶中的应用。

本发明还保护以上任一所述的重组菌的发酵上清。制备所述发酵上清的方法可如下：将所述重组菌振荡培养至OD600约为0.6时加入IPTG并使其浓度达到0.5mM，诱导培养后离心收集上清液。制备所述发酵上清的方法具体如下：将所述重组菌接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37°C、200rpm振荡培养至OD600约为0.6时加入IPTG并使其浓度达到0.5mM，然后20°C、200rpm振荡培养8小时，然后4°C、5000rpm离心30min并收集上清液。

本发明还保护所述发酵上清在制备β-葡萄糖苷酶中的应用。