[发明专利]β-胡萝卜素用于制备猪精液冷冻保护剂的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及动物精液的抗冻剂，特别是β-胡萝卜素用于制备猪精液冷冻保护剂的应用。 

背景技术

精液冷冻保存技术是随着人工授精技术发展起来的，是人工授精技术的重大革新。精液冷冻保存技术的原理是利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）或其它冷源，将精子经过适当的处理，使精子代谢完全停止。使用时在解冻进行人工授精和体外授精。精液冷冻可以大大提高种公畜的利用率，减少公畜的饲养量，节约成本且不受地域、时间的限制。有利于家畜品种的杂交改良，是家畜育种和珍惜濒危物种保护的有效技术手段。总之，精液的冷冻保存对研究人类生殖医学、促进家畜遗传育种、推广人工授精和保护濒危野生动物方面具有重要意义。 

目前，我国养猪业已经从传统的副业型转变为效益型、专业化的工厂化生产。猪精液冷冻技术在养猪生产和猪育种等方面具有重大意义，使人工授精技术不再受时间、地域限制；提高了优良种猪的利用率，延长的种公猪的使用年限；通过引进优秀种公猪精液代替以往引进活体公猪，有效的减少了育种成本；使地方品种资源得到了有效的保护。但是，由于猪精子细胞结构、成份的特异性，对温度变化较敏感，大量精子在冷冻过程中受到损伤，冻精活率、顶体完整率和质膜完整率明显低于鲜精，精子DNA和线粒体等的损伤也明显高于鲜精，导致在商品化养猪生产中，母猪的妊娠率、产仔率普遍降低，因此利用冷冻精液进行人工授精在养猪业实际生产中很难推广应用。尽管国内外研究学者已经对猪精子的冷冻保存进行了大量的研究，但是猪精 子冷冻解冻后的品质仍然不能够满足实际生产需要。 

在精液冷冻过程中，应用最广泛的抗冻保护介质就是甘油，甘油可以渗透进入细胞内部，缓解细胞内由于脱水而造成的渗透压变化。甘油作为一种渗透性保护剂，目前已经广泛应用到牛的冷冻精液商品化生产当中，并且取得了良好的抗冻效果。但是研究表明渗透性冷冻保护剂对精子均匀一定的毒害作用，尤其是猪精子对甘油浓度极为敏感，过高浓度的甘油会对猪精子造成严重的损伤。因此，对新型抗冻保护剂的研究就显得十分迫切。 

相关研究表明，精液在冷冻平衡过程中，不可避免的通过呼吸代谢产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），其所携带的氧自由基（O^2-、H₂O₂和-OH）能使精子细胞膜的不饱和脂肪酸发生氧化，造成精子细胞膜损伤，最终导致猪精子受精能力急剧下降。 

因此，在精液冷冻过程中，在稀释液中添加抗氧化成份可以起到一定的保护作用。 

发明内容

针对目前猪精液冷冻的不足之处，申请人在深入研究中发现，β-胡萝卜素作为一种抗氧化物质，可以减少自由基对细胞膜和细胞遗传物质的损伤，采用β-胡萝卜素制备猪精液冷冻保护剂，经实验证明，能有效提高猪精液冷冻-解冻后的精子活率、顶体完整率、质膜完整率。 

本发明制备的猪精液冷冻保护剂由冷冻基础液、β-胡萝卜素、新鲜鸡蛋黄和甘油组成，其中，β-胡萝卜素在每100mL冷冻基础液中的添加量为1mg～2mg，新鲜鸡蛋黄在每100mL冷冻基础液中的添加量为20ml，然后取添加β-胡萝卜素和新鲜鸡蛋黄的冷冻基础液97ml，加入甘油3ml，即制成100mL猪精液冷冻保护剂。 

所述每100mL的冷冻基础液中含有下列物质： 

葡萄糖：1.1g，柠檬酸：1.48g，Tris：2.42g，青霉素钠：0.06g，硫酸 链霉素：0.1g，余量为双蒸水。 

上述猪精液冷冻保护剂的制备包括下列步骤： 

1）取配方量的葡萄糖、柠檬酸、Tris、青霉素钠、硫酸链霉素、溶于100ml双蒸水中，调节pH至6.21，渗透压286mosm/L，配制成冷冻基础液； 

2）将步骤1）得到的冷冻基础液与20ml新鲜鸡蛋黄混匀，加入β-胡萝卜素1mg～2mg配制成Ⅰ液； 

3）取步骤2）所配制的Ⅰ液97ml，加入甘油3ml，配制成100ml的Ⅱ液； 

4）调节Ⅱ液pH值至6.0～7.5，渗透压286mosm/L，过滤灭菌，冷却至室温，得到猪精液冷冻保护剂，放入4℃冰箱中保存。 

上述猪精液冷冻保护剂用于猪精液的冷冻保存方法，其特征在于，按下列步骤操作： 

1）将新鲜精液离心，弃上清，加入等体积预温的冷冻稀释液，经纱布包裹后，在17℃恒温箱中平衡1-2h； 

2）将步骤1）平衡处理后的精液在17℃离心，弃上清，加入等温等体积I液，用纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1h～2h；