[发明专利]一种杨树遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种以悬浮细胞系为受体农杆菌介导的杨树遗传转化方法。

背景技术

杨树（Populus）作为木本植物中的模式植物，也是第一个全基因组测序的木本植物。利用转基因技术进行杨树基因功能的研究，已成为杨树基因组测序完成后开展后基因组学研究的重要内容。目前杨树转基因研究普遍以叶盘为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法，由于叶片细胞生理生化状态一致性较差，遗传转化条件难以统一，转化效率不高，影响杨树基因功能研究。悬浮细胞系生长迅速，且细胞状态均一性好，遗传转化条件容易控制，是良好的转基因受体材料。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杨树遗传转化方法，利用悬浮细胞系为受体材料进行遗传转化，提高转化效率，为林木的遗传改良提供了一个新途径。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种杨树遗传转化方法，包括以下步骤：

（1）取南林895杨幼嫩茎段和边缘有伤口的叶片，置于T培养基上诱导培养出愈伤组织；并经过T1培养基多次继代，筛选出状态良好的愈伤组织；其中，所述T培养基为MS+ 2,4-D 2~3mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；所述T1培养基为MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；

（2）将筛选出的愈伤组织进行悬浮培养，悬浮培养基为T2；其中，T2培养基为MS+2,4-D2mg/L +NAA0.2mg/L+KT0.1mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；

（3）从平板中挑取含有待遗传转化目的基因的农杆菌单菌落，接种到附加卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、220rmp振荡培养24h，先做菌液PCR鉴定目的基因，再取已经PCR检测的阳性菌液1mL转接到50mL含相应抗生素的LB培养基中，培养12-18h，5000rpm、4℃下离心10 min收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体，用于侵染；

（4）将步骤（2）的预培养后的悬浮细胞浸入步骤（3）的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回愈伤组织芽诱导培养基M上进行共培养；其中，菌液浓度OD₆₀₀为0.2-1.0，侵染时间为2-10min，共培养时间为1-7d；

（5）对共培养后的悬浮细胞洗涤除去农杆菌，转移到芽诱导筛选培养基M1上培养，直至分化出可见卡那霉素抗性（Kan^r)芽；培养基M1为MS+6-BA1.0mg/L +NAA 0.1mg/L +蔗糖30g/L +水晶洋菜1.8g/L +kan20mg/L，pH5.8，121℃，灭菌16min；

（6）将Kan^r芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基G(卡那霉素浓度同M1)继代培养；培养基G为MS+6-BA0.2mg/L+TDZ 0.001mg/L+cef200mg/L+ kan20mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/ L，121℃，灭菌16min；

（7）待Kan^r芽伸长至一定长度，将每个Kan^r芽分离独立接入不定芽伸长筛选培养基G筛选，至Kan^r芽长至一定长度后，移入生根筛选培养基G1；培养基G1为1/2MS+蔗糖25g/L+ cef200mg/L+kan15mg/L，pH5.8，琼脂7.5g/L, 121℃，灭菌16min。

步骤（3）中，所述的LB液体培养基中卡那霉素的浓度为10mg/L。

步骤（3）中，培养12-18h至OD₆₀₀值为0.6。

步骤（4）中，菌液浓度OD₆₀₀为0.6，侵染时间为4min，共培养时间为3d，芽诱导培养基M为MS+6-BA1.0mg/L+ NAA 0.1mg/ L +蔗糖30g/L +水晶洋菜1.8g/L， pH5.8，121℃，灭菌16min。

有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点包括：通过建立生长迅速且细胞状态均一性好的悬浮细胞系，实现简便、快速的杨树遗传转化系统，为杨树转基因操作提供新途径。

附图说明