[发明专利]一种杨树遗传转化方法

权利要求书

1.一种杨树遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取南林895杨幼嫩茎段和边缘有伤口的叶片，置于T培养基上诱导培养出愈伤组织；并经过T1培养基多次继代，筛选出状态良好的愈伤组织；其中，所述T培养基为MS+ 2,4-D 2~3mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；所述T1培养基为MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；

（2）将筛选出的愈伤组织进行悬浮培养，悬浮培养基为T2；其中，T2培养基为MS+2,4-D2mg/L +NAA0.2mg/L+KT0.1mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；

（3）从平板中挑取含有待遗传转化目的基因的农杆菌单菌落，接种到附加卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、220rmp振荡培养24h，先做菌液PCR鉴定目的基因，再取已经PCR检测的阳性菌液1mL转接到50mL含相应抗生素的LB培养基中，培养12-18h，5000rpm、4℃下离心10 min收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体，用于侵染；

（4）将步骤（2）的预培养后的悬浮细胞浸入步骤（3）的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回愈伤组织芽诱导培养基M上进行共培养；其中，菌液浓度OD₆₀₀为0.2-1.0，侵染时间为2-10min，共培养时间为1-7d；

（5）对共培养后的悬浮细胞洗涤除去农杆菌，转移到芽诱导筛选培养基M1上培养，直至分化出可见卡那霉素抗性芽；培养基M1为MS+6-BA1.0mg/L +NAA 0.1mg/L +蔗糖30g/L +水晶洋菜1.8mg/L +kan20mg/L，pH5.8，121℃，灭菌16min；

（6）将卡那霉素抗性芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基G继代培养；培养基G为MS+6-BA0.2mg/L+TDZ 0.001mg/L+蔗糖30g/L+cef200mg/L+ kan20mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/ L，121℃，灭菌16min； 

（7）待卡那霉素抗性芽伸长至2～3cm后，移入生根筛选培养基G1；培养基G1为1/2MS+蔗糖25g/L+cef200mg/L+kan15mg/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min。

2.根据权利要求1所述的杨树遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述T培养基为MS+ 2,4-D 2mg/L+蔗糖20g/L。

3.根据权利要求1所述的杨树遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的LB液体培养基中卡那霉素的浓度为10mg/L。

4.根据权利要求1所述的杨树遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，培养12-18h至OD₆₀₀值为0.6。

5.根据权利要求1所述的杨树遗传转化方法，其特征在于，步骤（4）中，菌液浓度OD₆₀₀为0.6，侵染时间为4min，共培养时间为3d，芽诱导培养基M为MS+6-BA1.0mg/L+ NAA 0.1mg/ L +蔗糖30g/L +水晶洋菜1.8g/L， pH5.8，121℃，灭菌16min。