[发明专利]一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法

说明书

技术领域

本发明属海洋生物技术领域，具体的说是一种牙鲆卵子与冷冻保存的夏鲆精子的种间杂交人工授精的方法。

背景技术

杂交育种是比较容易实施也容易见效的一种育种方法，它利用现有的品种或物种进行杂交，从其后代选育出符合人们需要的基因组合。选择地理远缘的物种作为杂交亲本，可以增加杂交子代的多态性，易于从它们的杂交后代出现多种多样类型，比较容易从中获得符合要求的新类型。牙鲆(Paralichthys olivaceus)和夏鲆（Paralichthys dentatus）是重要的海水养殖鱼种，分别分布于太平洋和大西洋沿岸，虽然属同一属，但地理分布距离较远。牙鲆（♀）与夏鲆（♂）作为亲本，通过人工授精方法，获得发育、生长正常的杂交子代。杂交子代继承了其亲本肉质细腻鲜美，营养丰富，食用价值高等特性，同时在人工养殖过程中表现出生长快、温度适应范围广，特别是耐高温等优点。但是牙鲆与夏鲆具有不同的生物学特性往往在人工培育过程中性腺发育不同步，同时牙鲆与夏鲆也常养殖于不同的地域这都造成种间杂交精子、卵子难于同步获得的难题。

发明内容

本发明目的在于提供一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法，将长期超低温冷冻保存的夏鲆精子经二步水浴解冻，溶解后夏鲆冻精中加入其3倍体积的稀释液，离心收集沉淀，而后与牙鲆卵子进行人工授精；其中，稀释液为NaCl，KH2PO4和水组成。

进一步的说，采集繁殖期精活力85%以上的夏鲆精子将其与抗冻液按体积比为1:3的比例在碎冰中轻轻震荡、充分混匀平衡5-6min；而后以-10℃/min的降温速率降温至-150℃，置于液氮中进行长期超低温冷冻保存，得到长期超低温冷冻保存的夏鲆精子。

所述抗冻液由抗冻剂、抗冻剂和稀释液组成；其中抗冻剂为13%的丙二醇（PG）、抗冻剂为浓度为30g/L的蔗糖。

所述二步水浴解是将冻精先置于37℃水浴锅中轻轻摇动90s，然后置于18℃水浴中轻轻摇动30s，进行二步水浴解，融解后置于0-4℃的冰盒中保存。

将所述经二步水浴解冻后夏鲆冻精与稀释液按体积比1:3的比例混合，混合后以800g的离心力离心5min，然后去掉上清液，获得与稀释前同样体积的冻精悬液，放置于0-4℃冰盒，待用。

将所述二步水溶解冻后夏鲆冻精与自然海水按体积比为1:40的比例混匀进行激活，激活后注入牙鲆卵子中，轻轻混匀，使牙鲆卵子与夏鲆冻精充分接触，静置5-10min；然后洗卵，用筛绢网过滤，将收集的受精卵放置于新鲜的海水中冲洗3～5次,冲洗后静置,取上浮卵进行孵化。

本发明所具有如下优点：

1.本发明采集性成熟夏鲆雄鱼优质精子经过超低温冷冻保存，然后获得与其同步的牙鲆卵子进行种间杂交进而实现人工授精。其中，夏鲆精子的超低温冷冻保存技术可以长期保存夏鲆冻精，随时、随地可以解冻应用。

2.本发明超低温冷冻保存夏鲆精子时以13%丙二醇（PG）为渗透性抗冻剂，蔗糖30g/L作为费渗透性抗冻剂，增加对冻精的保护效果且有效的降低毒性。

3.本发明超低温冷冻保存夏鲆精子解冻过程中采用37℃和18℃二步水浴解冻，避免了冻存管周围温度过高对冻精造成的损伤。

4.本发明冻精在用于人工授精前采用3倍体积稀释液稀释，800g的离心力离心洗脱，减少抗冻剂的毒性对冻精质量的影响同时不破坏精子的结构。

5.本发明人工授精过程中首先采用一定量海水将冻精激活然后倒入卵子中，海水在激活冻精的同时又可进一步洗脱抗冻剂对精子活力的影响；

6.本发明人工授精的重复性稳定性好，好冻精解冻后复苏率高，激活后运动率60-70%，受精率在50-70%，孵化率60-70%。

具体实施方式

实施例1

采集正值夏鲆生殖盛期的精子，即于烟台东方海洋亲鱼培育车间采集夏鲆精子，并存于干净的离心管中，显微镜检测活力高于90%，置于碎冰上带回实验室进行冷冻保存；

将上述采集的新鲜精子经过按1:3的体积比例与抗冻液混合在碎冰中（0℃）轻轻震荡、充分混匀3min，并分装到2ml冻存管中，然后置于降温仪中0℃平衡5min；再以-10℃/min的降温速率降温至-150℃，分装到冻存盒，置于液氮容器中，进行长期超低温冷冻保存，保存冻精65管；