[发明专利]一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法

权利要求书

1.一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法，其特征在于：将长期超低温冷冻保存的夏鲆精子经二步水浴解冻，溶解后夏鲆冻精中加入其3倍体积的稀释液，离心收集沉淀，而后与牙鲆卵子进行人工授精；其中，稀释液为NaCl，KH₂PO₄和水组成。

2.按权利要求1所述的夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法，其特征在于：采集繁殖期精活力85%以上的夏鲆精子将其与抗冻液按体积比为1:3的比例在碎冰中轻轻震荡、充分混匀平衡5-6min；而后以-10℃/min的降温速率降温至-150℃，置于液氮中进行长期超低温冷冻保存，得到长期超低温冷冻保存的夏鲆精子。

3.按权利要求2所述的夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法，其特征在于：所述抗冻液由抗冻剂、抗冻剂和稀释液组成；其中抗冻剂为13%的丙二醇（PG）、抗冻剂为浓度为30g/L的蔗糖。

4.按权利要求1或2所述的夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法，其特征在于：所述二步水浴解是将冻精先置于37℃水浴锅中轻轻摇动90s，然后置于18℃水浴中轻轻摇动30s，进行二步水浴解，融解后置于0-4℃的冰盒中保存。

5.按权利要求1所述的夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法，其特征在于：将经二步水浴解冻后夏鲆冻精与稀释液按体积比1:3的比例混合，混合后以800g的离心力离心5min，然后去掉上清液，获得与稀释前同样体积的冻精悬液，放置于0-4℃冰盒，待用。

6.按权利要求1或5所述的夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法，其特征在于：将二步水溶解冻后夏鲆冻精与自然海水按体积比为1:40的比例混匀进行激活，激活后注入牙鲆卵子中，轻轻混匀，使牙鲆卵子与夏鲆冻精充分接触，静置5-10min；然后洗卵，用筛绢网过滤，将收集的受精卵放置于新鲜的海水中冲洗3～5次,冲洗后静置,取上浮卵进行孵化。