[发明专利]用于抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌及其抗菌肽

权利要求书

1. 一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )C-D6，其保藏编号为：CGMCC No.5345。

2. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌C-D6，在抑制辣椒炭疽菌附着胞形成方面的应用。

3. 一种细菌培养液，包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其由以下步骤进行培养而成：

1）斜面活化培养的C-D6菌株；

2）摇瓶培养：将斜面活化培养的C-D6菌株接种到YPD液体培养基中进一步培养而得。

4. 如权利要求3所述细菌培养液，其特征在于：所述培养步骤1中，是从枯草芽孢杆菌C-D6的保藏菌种斜面划线接种到NA平板，37℃培养20-24 h，挑起单菌落接种到NA试管斜面，37℃培养20-24 h后，备用。

5. 如权利要求3所述细菌培养液，其特征在于：所述培养步骤2中，是将C-D6菌株接种到装有YPD液体培养基的培养瓶中，37℃，180 r/min振荡培养12 h后，按1%的接种量接种到相同培养瓶中，相同条件下震荡培养48 h，从而获得该细菌培养液。

6. 如权利要求3所述细菌培养液，其特征在于：所述YPD培养基组成成分为：酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0~7.2。

7. 一种抗菌蛋白，是由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌由以下分离纯化方法获得，该分离纯化方法包括如下步骤：

1）枯草芽孢杆菌细菌培养液的准备； 

2）硫酸铵沉淀分离：细菌培养液经20%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，离心沉淀蛋白，所得蛋白质沉淀用磷酸缓冲液悬浮，并用相同缓冲液透析48h后，离心弃沉淀，即得抗菌蛋白粗提液； 

3）抗菌蛋白纯化：采用AKTA蛋白纯化系统对蛋白粗提液进行进一步分离纯化。

8. 如权利要求7所述的抗菌蛋白，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌细菌培养液的准备进一步是由以下步骤获得：

1）斜面活化培养的C-D6菌株；

2）摇瓶培养：将斜面活化培养的C-D6菌株接种到YPD液体培养基中进一步培养而得；所述YPD培养基组成成分为：酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0~7.2。

9. 如权利要求7所述的抗菌蛋白，其特征在于：分离纯化方法的步骤2具体为：所述经20%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，离心收集沉淀蛋白，所得蛋白质沉淀用原体积1/15的磷酸缓冲液悬浮，并用相同缓冲液透析48h后，离心弃沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；所述纯化方法的步骤3具体为：以Sephadex G-75凝胶柱为分离柱，上样量为5 mL，流动相为50mmol/L pH 6.0的磷酸缓冲溶液，洗脱速度为0.5 mL/min，洗脱1.2倍柱体积；Sephadex G-75柱层析分离获得的活性产物通过阴离子交换层析Q-Fastflow进一步纯化，获得纯化活性蛋白；所述Q-Fastflow的分离条件为：流动相A：0.01mM 磷酸缓冲液（PB），pH 7.4；流动相B：1M NaCl洗脱液（含流动相A）；洗脱方式：线性梯度洗脱；洗脱时间：110min；洗脱速度：1mL/min；上样量：2mL/min。