[发明专利]区分大白菜TNL-E基因野生/突变状态的分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因的突变体及其相关位点特异性分子标记的开发与应用，尤其涉及一种区分大白菜TNL-E家族R基因野生型和突变体的特异性分子标记的开发和应用。本发明的标记可用于选择含野生型抗性位点的材料，为大白菜抗病育种提供辅助选择的手段，属于生物技术领域。

背景技术

植物基因组中存在着丰富的抗病基因(Resistance gene)即R基因，以保证其在生长发育的整个周期抵御种类繁多的病原微生物袭击。迄今克隆的R基因已经有100多个，深入分析发现：这些R基因编码产物一般包含亮氨酸拉链((Leucine zippers，LZ)、核酸结合位点(Nucleotidebinding site，NBS)、富含亮氨酸重复(Leucine-rich repeats，LRRs)、Toll/Interleukin-1受体类似结构(Toll/Interleukin-1receptor，TIR)、螺旋-螺旋基序(coiled coil，CC)、跨膜基序(Trans-membrane-domain,TrD)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Ser/Thrkinase,STK)活性或其它保守氨基酸序列。就特定的R基因而言，往往是上述几种基序的一种或几种基序的组合。根据R基因所包含的基序，将R基因大致分为八类(Gururani,MA;Venkatesh,J;Upadhyaya,CP;Nookaraju,A;Pandey,SK;Park,SW.2012.Plant disease resistance genes:Current status and future directions.Physiological and Molecular Plant Pathology.78:51–65.)，即TIR-NBS-LRR(简称TNL类)、CC-NBS-LRR、LRR-TrD、LRR-TrD-Kinase、TrD-CC、TIR-NBS-LRR-NLS-WRKY、LRR-TrD-PEST-ECS和Enzymatic R-genes。在已经报道的R基因中，其抗病谱非常广泛，既有针对细菌、真菌和鞭毛菌等病源物的，也有针对病毒的抗性。虽然特定的R基因只针对特定的病源效应子，但由于R基因以显性或半显性方式遗传，且数量众多，因而较隐性基因而言，这使其在育种工作中应用更方便(Staskawicz,B.J.,Ausubel,F.M.,Baker,B.J.,Ellis,J.G.,and Jones,J.D.G.1995.Molecular genetics of plant disease resistance.Science.268:661-667.)。

大白菜全基因组已经测序，并对其潜在的R基因进行了全面注释(Cheng,F.,Liu,S.,Wu,J.,Fang,L.,Sun,S.,Liu,B.,Li,P.,Hua,W.,Wang,X.2011.BRAD,the genetics and genomics database for Brassica plants.BMC plant biology.11:136.)。在大白菜全基因组测序的株系Chi-fu401中，有244个共计16类R基因，其中有绝大多数成簇存在，仅有少数以单拷贝形式存在且在拟南芥中没有相应的同源基因，我们推测这些R基因是大白菜特有的R基因，其存在状态与否有可能暗示大白菜能否抵抗大白菜特有的病害。迄今，在大白菜中尚未见R基因克隆的报道。

鉴于此，有必要对现有大白菜种质资源中这些特有的单拷贝R基因进行广泛筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发区分野生型与突变体的位点特异性分子标记。有以下几个方面的潜在益处：①可以将该标记用于筛查大白菜种群，提供高效的大白菜抗病R基因检测手段；②当其他位点发现突变类型时，可以采用同样的方法开发标记；③当多个位点的突变位于不同的材料中时，可以通过标记辅助选择手段将多位点的突变聚合在一起，创造广谱抗病大白菜新种质；④在培育广谱抗病大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。由于这种标记直接位于功能基因内部，因此选择的准确率达100%。同时也为重新评价大白菜资源的应用价值提供借鉴。

发明内容

针对上述现有技术，针对目前大白菜在R基因鉴定方面的空白，本发明首先获的了一个位于A04染色体上TNL-E家族的单拷贝基因的野生型和突变体，其次根据二者的序列差异，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的ASM显性标记并用于标记辅助选择。