[发明专利]旋毛虫PCR-DHPLC检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物源性食品中旋毛虫的检测方法，尤其涉及利用PCR及变性高效液相色谱（DHPLC）技术检测动物源性食品中旋毛虫的方法。还涉及检测所使用的组合物，即试剂盒。

背景技术

食品和农副产品中的有害生物主要包括细菌、病毒和寄生虫，据世界卫生组织1999年公布的人兽共患病中，有人兽寄生虫共患病58种，据解放军第四军医大学在2004年4月-2005年2月调查我国人兽寄生虫共患病91种。人兽共患寄生虫病，对公共卫生、人民健康、社会安定均带来严重的威胁和危害。

毛形线虫，简称旋毛虫，属于毛首目、毛形科、毛形属。其生活史特殊，以同一宿主作为中间宿主和终宿主，成虫寄生在宿主的小肠称肠旋毛虫，幼虫寄生于宿主的各部肌肉称肌旋毛虫。人、猪、狗等哺乳动物为其宿主，寄生在十二指肠及空肠前部，成虫附着于肠壁。幼虫胎生，经血液、淋巴分布到全身，只有在横纹肌中才继续发育，形成包囊。成熟包囊被寄主吞食后被感染，幼虫经4次脱皮，发育为成虫。

旋毛形线虫病为人畜共患的重要寄生虫病之一，其宿主除猪外，肉食动物、鼠类、人均可感染。家畜中以为畜猪为主，感染人时可致人死亡。旋毛虫分布于世界各地，在哺乳动物之间广泛传播，其主要原因有：宿主动物种类繁多，分布广，自然疫源丰富；肌肉包囊中幼虫的抵抗力很强，在—20℃可存活57天，在腐败的肌肉可存活100天以上，盐渍和烟熏均不能杀死肌肉深部的幼虫；猪、鼠都是杂食动物，一般认为感染旋毛虫的猪多好吞食死鼠、蝇蛆、洗肉水和肉屑等。犬的活动范围大，吃到动物尸体的机会多，感染的情况严重。因此，猪、鼠、犬及人之间相互传播是本病流行的关键所在。

我国对食品中旋毛虫的检测技术仍处于比较落后的阶段，检验方法还只限于传统的形态学检测，主要是应用目视法、压片显微镜镜检法、染色压片法和消化法，检测猪肉和牛肉等动物源性食品中的旋毛虫。检测步骤繁琐，方法灵敏度低；结果判断主要依据形态学检验，对于检验人员专业能力要求高且易受主观经验影响。采用ELISA方法检测寄生虫卵，特异性差、易出现假阳性。PCR检测技术具有准确、快速、灵敏度高、重复性好、稳定性高等优点。该方法弥补了常规方法检测周期长、繁琐、易受人为因素影响等不足。PCR-凝胶电泳检测方法虽然检测成本低，但反应产物电泳处理极易造成污染；特异性强，灵敏度高的实时荧光PCR方法，也存在检测成本较高，荧光探针保存时间较短等问题。

发明内容

本发明运用PCR结合DHPLC技术进行动物源性食品中旋毛虫检测。变性高效液相色谱（DHPLC）采用离子对反相高效液相色谱的原理，通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。与传统的旋毛虫检测及鉴定方法如形态学鉴定、免疫学技术、PCR-凝胶电泳等检测方法相比，本发明建立的方法及试剂盒，极大缩短了操作的时间，而且大大降低假阳性和假阴性结果的出现，使得结果更加准确、可靠。

本发明的技术方案为：提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用旋毛虫的特异性检测引物进行PCR扩增，再用DHPLC技术采集目的基因的图谱信息，直接从图谱信息读取旋毛虫的检测结果，在此基础上，本发明还对此方法进行了特异性和灵敏度检测；其具体操作步骤如下：

本发明的一方面在于：提供一种旋毛虫检测引物，具体为以下碱基序列：上游引物，SEQ ID NO.1；下游引物，SEQ ID NO.2。

本发明的另一方面在于：提供一种旋毛虫检测试剂盒，其包括上文所述的引物SEQ ID NO.1～2。

对于上述技术方案中所述的旋毛虫检测试剂盒，包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；分别独立包装；其中，所述的PCR反应液为混合液，其中含上文所述引物SEQ ID NO.1～2各10μM之外，还包括10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM。试剂盒保存条件：-20℃保存。

本发明的另一方面在于：提供一种动物源性食品中旋毛虫的检测方法，其利用上述技术方案中所述的旋毛虫引物检测试剂盒，对样品DNA进行PCR方法检测。

对于上述技术方案中所述的动物源性食品中旋毛虫的检测方法，其包括以下操作步骤：分别对样品按下述方法进行PCR检测：

①PCR反应体系为25μL，其中：

样品DNA                    2μL