[发明专利]旋毛虫PCR-DHPLC检测引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种旋毛虫PCR-DHPLC检测引物，其特征在于包括碱基序列：上游引物SEQ ID NO.1；下游引物SEQ ID NO.2。

2.一种旋毛虫PCR-DHPLC检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述引物SEQ ID NO.1～2。

3.根据权利要求2所述的旋毛虫PCR-DHPLC检测试剂盒，其特征在于：包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；

其中，所述的PCR反应液由权利要求1所述引物SEQ ID NO.1～2各10μM、Tris·HCl10mM、KCl 50 mM、MgCl₂ 25 mM、dNTP各2.5 mM组成。

4.一种动物源性食品中旋毛虫的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于：包括利用权利要求2所述的旋毛虫检测试剂盒，对样品DNA进行PCR方法检测。

5.根据权利要求4所述的动物源性食品中旋毛虫的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于：所述对样品DNA进行PCR方法检测的步骤包括：

① PCR反应体系为25μL，其中：

样品DNA                  2μL

5U/μL Taq DNA聚合酶     0.2μL

PCR反应液                12μL

水                       10.8μL

②反应条件：94℃预变性5min；进入循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环；72℃终止延伸10min。

6.根据权利要求5所述的动物源性食品中旋毛虫的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于：还包括以下操作步骤：

对权利要求5所述方法获得的PCR产物进行DHPLC分析，条件如下：

色谱柱：PS-DVB & C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相：0bp，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B，

100bp，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B，

300bp，39.4%缓冲溶液A，60.6%缓冲溶液B，

500bp，36.0%缓冲溶液A，64.0%缓冲溶液B，

700bp，34.3%缓冲溶液A，65.7%缓冲溶液B，

900bp，33.3%缓冲溶液A，66.7%缓冲溶液B，其中，

缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml；

缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物10μL。